污泥中产甲烷细菌多样性及产甲烷效能的优化研究

摘要

厌氧消化法是目前国际上处理城镇污泥应用最为广泛的方法，可使污泥减量化和资源化。厌氧消化过程中产生沼气的主要成分甲烷与氧气混合燃烧后能产生大量能量，能源效率明显高于薪柴、秸秆、煤炭等，因此厌氧消化在能源消费巨大、提倡节能减排的中国极具实际应用前景。产甲烷菌不仅作为厌氧消化微生物的核心，同时也是自然界碳素循环厌氧发酵的最后一个组成成员，产甲烷菌种的优劣直接影响厌氧消化效率的高低，因此获得高效稳定的产甲烷菌是十分有意义的。
　　本文首先富集5种污泥或沼液样品以获得产甲烷优势菌群，并结合变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术分析产甲烷菌群结构的多样性，再以累积产生甲烷量为指标选择甲烷产气量最多的样品用于研究各因素对产甲烷菌的影响，在此基础上采用响应面法优化产甲烷菌的产甲烷效能。在对5种污泥样品产甲烷菌群传代培养过程中发现，经过4次的传代培养后产甲烷菌的产甲烷能力均有不同程度的提高，其中累积产甲烷量最多的是实验室厌氧消化污泥，为3.964 L/L，累积产甲烷量最少的是林家厌氧消化池污泥沼液，仅为1.691 L/L。对5种厌氧菌群PCR-DGGE图谱分析显示，5种样品的微生物菌群都较为丰富，对DGGE条带的序列分析发现11种古菌与已有序列的相似性都在98％以上，优势菌群分属于甲烷鬃毛甲烷菌属（Methanosaeta）、甲烷粒菌属（Methanocorpusculum）、产甲烷菌属（Methanogenium）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）、甲烷微菌属（Methanomicrob ials）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷盘菌属（Methanoplanus）。因厌氧消化污泥菌群富集效果最好，累积产甲烷量最大，因此在研究产甲烷菌的影响因素及产甲烷效能的优化中选取此样品作为对象进行后续研究。
　　在研究影响产甲烷菌的各因素时，主要设定pH、接种量、氯化镍、氯化钴、硫酸亚铁5种因素开展研究。研究发现:pH为6.8时，累积产甲烷量、污泥生物量、甲酸利用率、比产甲烷速率呈现最大值，当pH为7.0时，甲烷含量、甲醇利用率、乙酸利用率呈现最大值。接种量在10％时，甲烷含量、累积产甲烷量、末端pH以及3种底物的利用率均呈现最大值。当在硫酸亚铁浓度分别为0.15 g/L、0.20 g/L时，累积产甲烷量和生物量分别达到最大值4.07 L/L和0.468 g/L。当氯化钴和氯化镍浓度分别0.15 g/L和0.03 g/L时，产甲烷菌的各个生理指标均呈现最大值。
　　在各因素对产甲烷影响研究基础上，仍以上述5种因素作为主要因素，以累积产甲烷量作为响应值，运用Box-Behnken的中心组合设计方法，设计5因素2水平共46组实验点进行响应面分析。经过响应面结果及方差分析，获得最佳实验条件:pH6.8，接种量13.29％，CoCl20.15 g/L，NiCl20.02 g/L和FeSO40.19 g/L。在此条件下的累积产甲烷量达到4.21 L/L，比经4次富集之后的产甲烷菌群累积产甲烷量高出6.21％，与模型预测值相近，说明此模型能够真实反应各种主要因素对累积产甲烷量的影响。

目录

摘要

1 绪论

1．1 产甲烷菌概述

1．2 产甲烷菌的生物学分类

1．3 产甲烷菌的代谢途径及独特的辅酶

1．3．1 产甲烷菌代谢底物及代谢途径

1．3．2 独特的产甲烷菌辅酶

1．4 产甲烷菌的影响因素

1．4．1 pH对产甲烷菌的影响

1．4．2 温度对产甲烷菌的影响

1．4．3 氧化还原电位对产甲烷菌的影响

1．4．4 微量元素对产甲烷菌的影响

1．4．5 氮氧化物对产甲烷菌的影响

1．5 变形梯度凝胶电泳在微生物生态研究中的应用

1．5．1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的原理

1．5．2 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术的应用

1．6 响应面优化法(Response surface methodology，RSM)

1．6．1 响应面优化法的特点

1．6．2 Plackett-Burman实验设计

1．6．3 Box-Behnken设计

1．6．4 中心组合设计

1．7 本论文的研究目的及主要内容

2 产甲烷菌群传代培养及菌群结构多样性分析

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 培养基

2．1．3 药品

2．1．4 主要仪器与设备

2．2 主要试剂配制方法

2．3 试验方法

2．3．1 菌群传代培养方法

2．3．2 厌氧发酵产甲烷实验方法

2．3．3 总气体产生量测定方法

2．3．4 甲烷含量测定方法

2．3．5 混合菌群总DNA提取方法

2．3．6 PCR扩增方法

2．3．7 DGGE电泳

2．3．8 DGGE条带分析

2．4 结果与分析

2．4．1 产甲烷菌群的富集

2．4．2 产甲烷菌的生长和产甲烷的关系

2．4．3 利用PCR-DGGE技术对产甲烷菌群的结构分析

2．5 讨论

2．6 本章小结

3 产甲烷效能的影响因素

3．1 材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 培养基

3．1．3 药品

3．1．4 仪器与设备

3．2 试验方法

3．2．1 厌氧发酵产甲烷实验方法

3．2．2 总气体产生量测定方法

3．2．3 甲烷含量测定方法

3．2．4 挥发酸浓度测定方法

3．2．5 产甲烷指标的计算方法

3．3 结果与分析

3．3．1 pH对产甲烷效能的影响

3．3．2 接种量对产甲烷效能的影响

3．3．3 钴离子对产甲烷效能的影响

3．3．4 镍离子对产甲烷效能的影响

3．3．5 亚铁离子对产甲烷效能的影响

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 响应面法优化产甲烷菌产甲烷效能

4．1 材料

4．1．1 实验材料

4．1．2 培养基

4．1．3 药品

4．1．4 仪器与设备

4．2 试验方法

4．2．1 厌氧发酵产甲烷实验方法

4．2．2 总气体产生量测定方法

4．2．3 甲烷含量测定方法

4．2．4 产甲烷指标的计算方法

4．3 结果与分析

4．3．1 响应面法实验设计

4．3．2 响应面实验结果与分析

4．3．3 响应面分析

4．3．4 最优条件确立及模型验证实验

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢

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