分月扇舟蛾几丁质酶dsRNA转化杨树及其抗虫性的研究

摘要

几丁质酶基因作为昆虫中重要的一种酶类基因，参与生物体生长发育期间的蜕皮及新表皮的形成过程。RNAi(RNA interence)作为一种重要的基因沉默方式，它在研究生物基因功能和防治方面得到了广泛的应用和研究。本文对分月扇舟蛾的几丁质酶基因进行了克隆，并根据其基因序列进行了它的生物信息学分析。以山新杨的叶片作为外植体，构建了几丁质酶基因Chi干涉表达载体pBI121-Chif-intron-Chir，利用根癌农杆菌介导法对山新杨进行遗传转化，并对转化株系进行了筛选、PCR检测，Chi基因的表达量的检测，并对其进行了抗虫性的研究，获得了如下主要结果:
　　1、采用STE法提取分月扇舟蛾的RNA，并通过反转录获得cDNA，利用PCR技术对分月扇舟蛾的几丁质酶基因进行了克隆，并根据其测序的序列对其进行基因的序列分析，了解它的氨基酸组成及含量，对其氨基酸序列进行了保守区和神经肽的预测，并与其氨基酸序列相似的27种几丁质酶基因进行了多序列对比并作出进化树，构建出几丁质酶基因的蛋白质三级结构模型。
　　2、提取分月扇舟蛾的基因组DNA，利用PCR技术克隆得到分月扇舟蛾神经肽PBAN基因的第三个内含子部分序列。以分月扇舟蛾的RNA为模版，利用PCR技术克隆得到Chi基因的保守区部分序列，然后将其正向和反向与PBAN基因内含子基因片段通过酶切连接转化等一系列的操作构建到中间载体pUC19上，并以卡纳霉素作为筛选基因抗生素的干涉表达载体pBI121-Chif-intron-Chir。最后将重组载体成功的导入到农杆菌EHA105中。
　　3、以山新杨作为外植体，对其进行抗生素的敏感性测定，并建立了最佳的遗传转化体系，通过选择培养获得了具有目的片段的转基因山新杨植株，并通过PCR技术最终确定获得了7株具有目的片段的转基因山新杨植株，通过荧光定量PCR确定了7种转基因山新杨株系中表达量T4＞T7＞T2＞T6＞T5＞T3＞T1.
　　4、对含有Chi基因的RNAi转基因山新杨进行组织培养，扩大繁殖，饲喂分月扇舟蛾通过荧光定量PCR发现Chi基因含量均降低，转化株系T3变化最为明显，T6转基因株系的变化最小。饲喂舞毒蛾，发现转基因山新杨株系对舞毒蛾的发育历期、体重和死亡率均无明显影响。

目录

摘要

1 绪论

1．1 杨树的生物学特性分布、地位发展概况以及主要虫害

1．1．1 杨树的生物学特性和分布

1．1．2 杨树在国民经济及林业中的地位和发展概况

1．1．3 杨树的主要虫害

1．1．4 杨树害虫的防治

1．2 几丁质酶作用机理和应用

1．2．1 几丁质酶的作用机理

1．2．2 几丁质酶的应用

1．3 RNAi的作用机理，特点以及在害虫防治中的应用

1．3．1 RNAi的定义

1．3．2 RNAi作用机理

1．3．3 RNAi特点

1．3．4 RNAi在昆虫中应用

1．3．5 RNAi在害虫防治中的应用

1．4 本实验的目的意义

2 分月扇舟蛾几丁质酶基因的克隆和生物信息学分析

2．1 试验材料

2．1．1 供试虫体和菌株

2．1．2 常用溶液配置

2．1．3 试验设备

2．1．4 实验所需酶及试剂

2．2 试验方法

2．2．1 分月扇舟蛾总RNA的提取

2．2．2 反转录cDNA第一链的合成

2．2．3 分月扇舟蛾几丁质酶基因的全长获得

2．2．4 核苷酸测序

2．3 Chi基因的生物信息学分析

2．4 结果与分析

2．4．1 分月扇舟蛾总RNA的提取

2．4．2 分月扇舟蛾几丁质酶基因cDNA序列的扩增

2．4．3 分月扇舟蛾几丁质酶基因的序列分析

2．4．4 分月扇舟蛾几丁质酶基因的生物信息学分析

2．5 关于分月扇舟蛾的几丁质酶基因家族的讨论

2．6 本章小结

3 分月扇舟蛾几丁质酶基因dsRNA载体构建及杨树转化

3．1 试验材料

3．1．1 供试虫体，菌株

3．1．2 供试试剂

3．1．3 仪器设备

3．1．4 有关试剂的配制

3．1．5 有关培养基的配置

3．2 试验方法

3．2．1 几丁质酶基因RNAi载体构建策略

3．2．2 分月扇舟蛾总DNA的提取

3．2．3 目的基因的获得

3．2．4 植物表达载体的构建

3．2．5 RNAi载体转化农杆菌

3．2．6 重组载体的鉴定

3．2．7 抗生素的筛选

3．2．8 农杆菌介导法转化干涉载体pBI121-Chif-intron-Chir

3．2．9 转基因杨树的PCR检测

3．2．10 荧光定量PCR检测Chi基因在山新杨中的表达

3．3 结果与讨论

3．3．1 分月扇舟蛾基因组DNA的提取

3．3．2 目的片段的扩增

3．3．3 中间载体pUC19-Chif-intron-Chir构建验证

3．3．4 RNAi植物表达载体pBI121-Chif-intron-Chir构建验证

3．3．5 RNAi植物表达载体pBI121-Chif-intron-Chir导入农杆菌的验证

3．3．6 卡那霉素，头孢霉素筛选浓度的测定

3．3．7 根癌农杆菌转化山新杨

3．3．8 转基因杨树总RNA的提取

3．3．9 分月扇舟蛾的几丁质酶RNA片段在转基因杨树中的表达量

3．4 关于几丁质酶基因dsRNA转山新杨的讨论

3．4．1 杨树品种的确定

3．4．2 构建载体的内含子的确定

3．4．3 目标基因片段的选择

3．4．4 关于抗生素筛选

3．5 本章小结

4 转基因植株的抗虫性研究

4．1 实验材料

4．1．1 供试树种

4．1．2 供试昆虫

4．2 实验方法

4．2．1 转dsRNA几丁质酶基因的山新杨抗分月扇舟蛾研究

4．2．2 转dsRNA几丁质酶基因的山新杨抗舞毒蛾研究

4．3 结果与讨论

4．3．1 分月扇舟蛾总RNA的提取

4．3．2 几丁质酶基因在分月扇舟蛾内的表达量

4．3．3 转基因株系对舞毒蛾幼虫各龄历期和发育速率的影响

4．3．4 转基因株系对舞毒蛾幼虫体重的影响

4．3．5 转基因株系对舞毒蛾幼虫死亡率的影响

4．3．6 舞毒蛾幼虫取食行为和死亡症状

4．4 关于转基因杨树抗虫性的讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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