佛坪自然保护区大熊猫蛔虫感染调查及蛔虫进化分析

摘要

大熊猫是我国特有的珍贵濒危动物，是野生动物保护中的旗舰物种，被誉为“活化石”，现存的主要栖息地是四川、陕西和甘肃的山区。蛔虫是大熊猫最为常见的寄生虫，危害极大。本研究扩增了大熊猫蛔虫的ITS和5.8S序列，并结合已有的18S基因序列研究其在蛔虫目中的进化地位，并对佛坪自然保护区野生大熊猫蛔虫病的流行进行了为期一年的监测，评估温度、露点、海拔、竹型等非生物因子对其的影响。
　　2012年，在陕西省佛坪国家级自然保护区共采集193份大熊猫粪便样品。采用饱和食盐水漂浮法对样品中的虫卵进行分离，并通过形态学鉴定虫卵。结果显示101份为阳性，并且鉴定为施氏贝蛔虫。此外，采用分子生物学手段扩增获得了阳性样品中施氏贝蛔虫的ITS-1、5.8S和ITS-2基因片段。基于5.8S和ITS-2基因序列的进化分析结果表明大熊猫蛔虫属于贝蛔属，与转移拜林蛔虫亲缘关系最近。基于ITS-1和18S基因序列的进化分析表明蛔虫与宿主存在紧密的协同进化关系，动物蛔虫进化存在两个起源点，即哺乳动物单独起源于一个点，鸟类起源于另外一个点。
　　利用麦克马斯计数法进行粪样中虫卵的检测，结果显示，佛坪自然保护区大熊猫施氏贝蛔虫的年度感染率为52.3％(101/193)，全年平均感染强度89.27个/g，单个个体感染强度最高达到1147个/g。从4月份开始感染强度与感染率开始上升，6、7月份达到顶峰，后逐渐下降。此外，流行病学监测结果显示施氏贝蛔虫流行存在季节与区域差异:春夏季蛔虫的感染率(71.0％、77.4％)显著高于秋冬季蛔虫的感染率(22.5％、18.4％)，春夏季蛔虫的平均感染强度(167.74个/g、119.81个/g)显著高于秋冬季的平均感染强度(9.25个/g、2.89个/g)，巴山木竹林区大熊猫蛔虫平均感染强度(125.0个/g)显著高于秦岭箭竹区域（50.8个/g）。相关性分析表明:温度与感染强度呈正相关(r=0.328，p＜0.01)，温度高于15℃后，施氏贝蛔虫的感染率与感染强度都显著增高;露点与感染强度呈正相关(r=0.328，p＜0.01);海拔与感染强度呈负相关(r=-0.224，p＜0.01)。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 蛔虫病的简介

1．2．1 施氏贝蛔虫的形态研究

1．2．2 蛔虫的发育史

1．2．3 蛔虫病的流行特点

1．2．4 蛔虫病的致病作用、病理变化及临床症状

1．3 线虫的分类现状和常用的标记基因

1．4 佛坪自然保护区大熊猫生存挑战

1．5 本研究的目的意义

2 施氏贝蛔虫的形态鉴定和进化分析

2．1 试验材料

2．1．1 试验试剂

2．1．2 试验仪器

2．1．3 试验样品

2．2 试验方法

2．2．1 虫卵的收集

2．2．2 蛔虫虫卵的DNA提取

2．2．3 PCR反应及条件

2．2．4 胶回收

2．2．5 感受态细胞的制备

2．2．6 ITS基因与pDM-18T载体的连接

2．2．7 连接产物的转化

2．3 结果

2．3．1 施氏贝蛔虫虫卵形态观察结果

2．3．2 PCR反应结果

2．3．3 蛔虫的测序结果

2．3．4 基于ITS-1序列的同源性比较及进化分析

2．3．5 基于ITS2和5．8S的同源性比较及进化分析

2．3．6 基于18S序列的进化分析

2．4 讨论

2．5 小结

3 佛坪自然保护区大熊猫施氏贝蛔虫的流行规律及其影响因素

3．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．1 蛔虫感染率和感染强度检查

3．2．2 运用Aregis提取数据并绘图

3．2．3 运用SPSS17．0进行数据分析

3．3 结果

3．3．1 佛坪自然保护区大熊猫施氏贝蛔虫的流行动态

3．3．2 温度对感染强度和感染率的影响

3．3．3 露点与感染强度相关分析

3．3．4 海拔与感染强度相关分析

3．3．5 邻近河流距离与感染强度的相关分析

3．3．6 多因素相关分析及回归方程的建立

3．4 讨论

3．5 小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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