水曲柳节律基因LHY启动子克隆及功能研究

摘要

本研究以水曲柳(Fraxinus mandshurica Rupr.)为材料，运用改良Site Finding-PCR法分离了LHY基因启动子序列，并对其顺式作用元件进行分析。构建了植物瞬时表达载体pPXGFP-P-LHY和植物表达载体pPCXGUS-P-LHY，通过GFP检测、GUS组织化学染色研究LHY基因启动子的启动活性;通过GFP检测、GUS酶活力检测、GUS基因定量分析研究LHY基因启动子对非生物胁迫的响应。研究干旱诱导的水曲柳亲本及杂交F1代DNA甲基化模式的变化，探究其与水曲柳耐旱杂种优势的关系。主要结果如下：
　　1、水曲柳LHY基因启动子的克隆及其活性分析
　　克隆了水曲柳LHY基因上游启动子区(1360 bp)。生物信息分析表明该启动子中含有重要的转录必备元件（TATA box、CAAT box）、逆境调控元件（如抗旱响应元件）、激素响应元件（如赤霉素、茉莉酸等的调控元件）、光响应元件(AE-box、BOXI、GAG-motif、LAMP-element等)及节律相关的Circadian元件。转化烟草并进行GFP检测和GUS组织染色结果显示，LHY基因启动子具有启动活性。
　　2、LHY启动子对非生物胁迫的响应
　　pPXGFP-P-LHY侵染的白桦悬浮细胞，测定其对非生物胁迫(NaCl)下的响应。GFP检测结果显示，重组表达载体pPXGFP-P-LHY中的启动子LHY能够启动表达。在非生物胁迫下，启动子仍可启动表达，从荧光的明亮程度看，与对照相比较，在盐胁迫下表达水平相对升高了。
　　pPCXGUS-P-LHY侵染的烟草植株，测定其对非生物胁迫(NaCl、PEG)下的响应。GUS酶活力和GUS基因转录表达的定量分析显示，GUS酶活力/GUS基因相对表达量随着干旱、盐胁迫时间的增加先升高后降低，在干旱胁迫3h的时候GUS酶活力/GUS基因相对表达量最高，在盐胁迫6h的时候GUS酶活力/GUS基因相对表达量最高，高于对照组。说明在非生物胁迫下，LHY启动子仍可肩动表达。且LHY基因启动子中的逆境调控元件对非生物胁迫产生了响应。
　　3、节律基因LHY启动子区及编码区甲基化分析
　　以干旱处理的父本、母本、杂交子代（水曲柳做母本、大叶白蜡做父本杂交所得的白蜡属种间杂种F1）水曲柳为材料。用亚硫酸盐处理测序法对LHY基因启动子区及编码区甲基化分析显示，和对照组及处理组亲本相比，只有干旱处理的杂交子代中某些甲基化水平降低且某些原本甲基化的位点发生了去甲基化。LHY基因荧光定量结果显示，干旱胁迫下杂交子代的相对表达量高于亲本。

目录

摘要

1 绪论

1．1 节律基因简介

1．2 节律基因的研究进展

1．3 启动子的相关研究进展

1．3．1 植物基因启动子的结构及分类

1．3．2 植物基因启动子的克隆方法

1．4 节律基因与非生物胁迫

1．5 植物DNA甲基化研究背景

1．6 植物DNA甲基化研究方法

1．6．1 高效液相色谱法

1．6．2 亚硫酸盐处理测序法

1．6．3 MSAP法

1．6．4 荧光法

1．7 表观修饰与杂种优势

1．8本研究的目的意义

2 水曲柳LHY基因启动子的克隆及其活性分析

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 水曲柳LHY基因启动子的克隆和生物信息学分析

2．2．2 LHY启动子pPXGFP-P植物瞬时表达载体的构建

2．2．3 LHY启动子pPCXGUS-P植物表达载体的构建

2．2．4 表达载体导入农杆菌

2．2．5 LHY启动子在烟草中的瞬时表达

2．2．6 LHY启动子在烟草中的表达活性分析

2．3 结果与分析

2．3．1 水曲柳基因组DNA提取

2．3．2 水曲柳LHY基因启动子克隆

2．3．3 重组质粒PCR鉴定及测序结果

2．3．4 水曲柳LHY基因启动子顺式作用元件的鉴定及分析

2．3．5 pPXGFP-P和pPCXGUS-P植物表达载体的构建与鉴定

2．3．6 瞬时GFP活性检测

2．3．7 GUS组织化学染色

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 节律基因LHY启动子对非生物胁迫的响应

3．1 试验材料及试剂

3．2 试验方法

3．2．1 非生物胁迫下LHY启动子在白桦细胞中的瞬时表达

3．2．2 LHY启动子诱导活性在烟草中的定量研究

3．3 结果与分析

3．3．1 非生物胁迫下LHY启动子活性

3．3．2 蛋白含量标准曲线

3．3．3 对硝基苯酚标准曲线

3．3．4 GUS酶活力的定量分析

3．3．5 烟草总RNA完整性检测

3．3．6 cDNA合成效果的检测

3．3．7 GUS基因荧光定量PCR分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 节律基因LHY启动子区及编码区甲基化分析

4．1 试验材料

4．2 试验方法

4．2．1 亚硫酸盐测序法

4．2．2 LHY编码区干旱胁迫定量分析

4．3 结果与分析

4．3．1 水曲柳基因组DNA提取

4．3．2 BSP扩增结果

4．3．3 LHY基因启动子区甲基化分析

4．3．3 LHY基因编码区甲基化分析

4．3．4 水曲柳总RNA完整性检测

4．3．5 cDNA合成效果的检测

4．3．5 荧光定量PCR

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明