欧洲白桦BpCUC2基因及其启动子的克隆与功能研究

摘要

CUP-SHAPED COTYLEDON2(CUC2)属于植物特有转录因子NAC家族成员，由于其在植物SAM的起始与维持，器官边界的界定等方面发挥重要作用，近年来受到了越来越多的关注。然而，对CUC2基因的研究，目前多集中在拟南芥等少数模式植物或经济作物上，木本植物中的研究尚未见报道。本研究以欧洲白桦为试材，初步分析BpCUC2基因功能及其组织表达特异性，为人们进一步了解白桦生长发育的确切机制及利用BpCUC2基因改造植物形态打下基础。
　　本研究首先利用PCR技术，克隆了BpCUC2基因，将其与CaMV35S强启动子融合构建植物表达载体并对基因序列进行分析;进而利用实时荧光定量PCR技术，对欧洲白桦幼苗不同组织部位中BpCUC2基因相对表达量进行分析;又从欧洲白桦全基因组中克隆了BpCUC2基因启动子，将其与Luc2萤火虫荧光素酶基因融合，遗传转化拟南芥，利用植物活体成像系统，分析启动子序列并研究BpCUC2基因的组织表达特异性;最后将BpCUC2基因遗传转化拟南芥，获得高表达BpCUC2基因的拟南芥，观察高表达BpCUC2基因拟南芥表型变化。
　　研究结果显示:1、BpCUC2基因可能的全长为2126bp，其中5'UTR长52 bp，3'UTR长204bp，CDS全长1065bp，具有3段外显子和2段内含子;2、欧洲白桦幼苗不同组织部位BpCUC2基因表达量存在明显差异，其表达量水平由高到低依次为茎尖、茎、根和叶，其中茎尖内的表达量是叶片内的6倍左右;3、BpCUC2启动子核心区仅含有TATA框和起始子。此外，启动子中还含有众多不同类型的顺式作用元件，涉及组织特异表达、激素响应、环境胁迫响应和转录因子结合等不同方面;4、BpCUC2启动子驱动的Luc2报告基因主要在SAM、叶片边缘及花等组织器官中表达，其中SAM区表达活性最高;5、高表达BpCUC2基因拟南芥各株系普遍表现为具有多个SAM，子叶开裂成细条状，莲座叶叶片数和主茎数显著增加，组织器官变小，株高变矮，发育迟缓等特点。
　　上述结果表明，BpCUC2基因主要作用在分生组织活跃部位，在白桦的整个生长周期内发挥重要作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 研究背景

1．1．1 欧洲白桦

1．1．2 NAC转录因子

1．1．3 植物顶端分生组织建成

1．1．4 叶片边缘形态建成

1．2 CUC2基因研究进展

1．2．1 CUC2基因简介

1．2．2 CUC2蛋白的结构特征

1．2．3 CUC2基因的功能

1．3 本研究目的和意义

2 BpCUC2基因的克隆、载体构建及生物信息学分析

2．1 实验材料

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与软件

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA提取及cDNA的合成

2．2．2 BpCUC2基因全长cDNA的克隆

2．2．3 BpCUC2基因植物表达载体构建

2．2．4 BpCUC2生物信息学分析

2．3 结果与分析

2．3．1 总RNA质量检测

2．3．2 BpCUC2基因全长cDNA的克隆

2．3．3 BpCUC2基因植物表达载体构建分析

2．3．4 BpCUC2蛋白一级结构预测

2．3．5 BpCUC2蛋白二级结构预测

2．3．6 BpCUC2模体的识别和解析

2．3．7 BpCUC2蛋白三级结构预测

2．3．8 BpCUC2与其他物种的相似性比较及分子进化遗传分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 欧洲白桦不同组织部位BpCUC2基因差异表达分析

3．1 实验材料

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 仪器与软件

3．2 实验方法

3．2．1 组织培养与组培苗的移栽

3．2．2 总RNA提取及cDNA的合成

3．2．3 实时荧光定量PCR

3．3 结果与分析

3．3．1 定量引物特异性与方法可行性分析

3．3．2 BpCUC2基因组织表达差异分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 白桦BpCUC2基因启动子的克隆及功能分析

4．1 实验材料

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 仪器与软件

4．2 实验方法

4．2．1 基因组DNA的提取与启动子区域的克隆

4．2．2 电泳检测及PCR产物回收

4．2．3 BpCUC2基因启动子植物表达载体构建

4．2．4 拟南芥的遗传转化

4．2．5 Luc2组织化学定位

4．2．6 BpCUC2基因启动子的序列分析

4．3 结果与分析

4．3．1 BpCUC2基因启动子区域的克隆

4．3．2 重组质粒DNA拼接测序

4．3．3 转BpCUC2基因启动子拟南芥的筛选和PCR验证

4．3．4 PBpCUC2：：Luc2在转基因拟南芥中的表达分析

4．3．5 BpCUC2基因启动子的序列分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

5 高表达BpCUC2基因拟南芥的获得及表型分析

5．1 实验材料

5．1．1 材料与试剂

5．1．2 仪器与软件

5．2 实验方法

5．2．1 拟南芥的遗传转化

5．2．2 高表达BpCUC2基因拟南芥表型观察

5．3 结果与分析

5．3．1 高表达BpCUC2基因拟南芥筛选与PCR验证

5．3．2 高表达BpCUC2基因拟南芥表型分析

5．4 讨论

5．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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