CBF-β促进SIVagm Vif功能的生化分析

摘要

APOBEC3蛋白家族是一类重要的慢病毒复制的免疫限制因子。慢病毒编码的辅助蛋白Vif可以与Cullin5-Elongin B-Elongin C形成E3泛素化连接酶复合物使APOBEC3G(A3G)聚泛素化和降解，从而抑制A3G对病毒的限制。CBF-β为RUNX家族转录辅助因子，可以调节Vif介导的A3G降解作用。为探索CBF-β对非洲绿猴猴免疫缺陷病毒Vif蛋白(SIVagm Vif)的调节机制以及对A3G降解的影响，本研究通过生化及病毒学方法对SIVagm和HIV-1编码的Vif蛋白与CBF-β作用进行了对比性研究。
　　结果显示，SIVagm编码的Vif对相应物种A3Gagm的降解同样需要CBF-β的辅助。在生化功能实验当中，CBF-β辅助SIVagm Vif蛋白介导的A3Gagm降解机制与HIV-1 Vif蛋白具有一定的相似性，同样通过CBF-β促进SIVagm Vif蛋白在细胞内的稳定性及打破SIVagm Vif蛋白在细胞内的寡聚化聚集状态，使SIVagm Vif更有效的降解相应物种的A3Gagm。由此推测，CBF-β辅助Vif介导的降解A3G的作用在灵长类慢病毒中具有保守性。
　　当Vif(HIV-1/SIVagm)缺失N端12个氨基酸后，CBF-β辅助Vif蛋白调节A3G降解的能力显著降低。研究Vif蛋白缺失体的生化功能实验结果显示，Vif缺失体失去了与CBF-β的相互作用，CBF-β不能促进Vif缺失体在细胞内的稳定性，Vif在细胞内仍然主要以高聚体形式存在。由此表明，慢病毒编码的Vif蛋白N端12个氨基酸对与CBF-β的相互作用具有重要作用。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．1．1 慢病毒研究概况

1．1．2 APOBEC与Vif的相互作用

1．1．3 国内外相关研究现状及发展趋势

1．1．4 研究的目的与意义

2 质粒的构建及鉴定

2．1 实验材料

2．1．1 质粒及菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 PCR扩增Vif、CBF-β片段及其产物检测和回收

2．3 实验结果与分析

2．3．1 HIV-1 Vif和SIVagm Vif序列对比分析

2．3．2 HIV-1 Vif蛋白复合体结构预测

2．3．3 构建HIV-1 Vif、SIVagm Vif及相应氨基酸截短的表达质粒

2．3．4 Vif、CBF-β片段的PCR扩增

2．3．5 克隆产物双酶切鉴定

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 CBF-β促进SIVagm-Vif功能的生化分析

3．1 实验材料

3．1．1 质粒及细胞株

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 HEK293T及Hala细胞的培养

3．2．2 细胞转染

3．2．3 Western Blot检测

3．2．4 间接免疫荧光实验

3．2．5 蔗糖密度梯度离心实验

3．2．6 CHX稳定性实验

3．2．7 CBF-β对SIVagm Vif功能影响实验

3．3 实验结果

3．3．1 CBF-β辅助SIVagm Vif降解APOBEC的检测结果

3．3．2 HIV-1 Vif、SIVagm Vif缺失N端12个氨基酸对A3G降解能力的检测

3．3．3 CBF-β对SIVagm Vif细胞内稳定性的检测结果

3．3．4 CBF-β对HIV-1 Vif △12aa、SIVagm Vif △12aa蛋白在细胞内的稳定性的检测

3．3．5 CBF-β对SIVagm Vif蛋白在细胞内分布状态影响的检测

3．3．6 CBF-β对HIV-1 Vif △12aa、SIVagm Vif △12aa蛋白在细胞内分布状态影响的检测

3．3．7 CBF-β对Vif蛋白寡聚化影响的检测结果

3．3．8 CBF-β对缺失N端12个氨基酸的Vif蛋白寡聚化影响的检测结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明