蓝桉精油的高效分离及对马铃薯干腐病镰刀菌抑制作用的研究

摘要

从天然植物中开发安全无毒、性能稳定的天然杀菌剂已成为了研究热点。蓝桉为我国引种的速生纤维原料植物，在我国四川、云南等省广泛栽培，无论是在中国还是在其他种植地区都是民间常用的植物药，特别是其蓝桉叶油中富含的桉叶油素具有良好的抑菌、消炎、镇痛等生物特性，是开发利用新型天然杀菌剂的良好材料。蓝桉叶精油在杀菌抑菌方面的作用机制受到很多学者的关注，已经成为病理学、分子生物学、微生物学研究的热点之一。
　　马铃薯主要的采后病害是干腐病，它也是限制其产业化良性发展的主要原因之一。目前，市场上对于干腐病的控制主要是利用化学合成杀菌剂。然而，近年来由于人们对食品安全问题关注度的不断增加，和由于各种化学药剂所引起的社会问题、环境问题的不断发生，例如水污染、人畜生命安全等，以及由于大范围合成杀菌剂的使用，会使菌株的耐药性增强，使其对于化学合成剂不断地适应，最终，导致合成杀菌剂对菌株作用的无效，而使其应用范围受到越多限制。因此，研究人员正在积极的寻找更为合适且高效安全的杀菌剂，来逐步的取代或者尽量减少有毒有害的化学杀菌剂的应用。
　　以黑龙江马铃薯致病菌镰刀菌为实验材料，采用植物学、分析化学以及分子生物学等方法研究蓝桉精油对致病菌镰刀菌的抑菌特性，目的使其在实际防治马铃薯干腐病中得到应用，实验内容主要为以下几个方面:
　　1.采用酶预处理-无溶剂真空微波辅助法提取蓝桉精油，并对提取工艺进行了优化:
　　经复合酶预处理蓝桉鲜叶后，原料中的单萜糖苷脱糖，增加了精油得率;同时，酶的处理使油细胞的细胞壁发生降解，降低了精油组分的提取阻力，加速精油组分的蒸馏，精油提取采用真空条件下微波蒸馏，保证了蒸馏操作在相对低的温度下进行，避免了精油组分的异构化、氧化变性，最终提高了蓝桉叶精油总提取率。实验通过比较酶处理前后，蓝桉叶乙醇提取物中单糖含量种类和数量的变化，发现经酶预处理后的提取物中，单糖的种类没有发生改变，但是，单糖的数量都有明显的增加，证实精油得率的增加源自于萜苷类的脱糖基作用。同时，比较了不同提取方法的蓝桉叶扫描电镜图像，经检测植物叶表皮细胞不同程度的发生改变，气孔细胞和表皮细胞的排列以及表面晶体蜡质都不同。实验对蓝桉叶的含水率、提取时间和微波功率等因素进行了系统考察研究，建立了拟合良好的模型和方程，并得出提取精油的最佳条件为:含水率60％、萃取时间27min、微波功率548W，在此条件下精油得率为6.98mL/kg，此模型的精密度为21.78，相对标准偏差1.68％，经过系统的评价，该种提取蓝桉叶精油创新工艺不仅提升了精油的得率，而且很好的保护了精油的品质特性，对于精油组分的提取制备，提供了一种绿色环保的新思路，并且运用酶预处理-无溶剂真空微波法，提取植物精油的相关报道较少。
　　2.采用蓝桉叶精油对马铃薯干腐病致病菌镰刀菌的抑菌实验中，发现蓝桉叶精油及其主要单体组分对干腐病致病菌均有抑制菌丝生长的作用，对镰刀菌的最低抑菌浓度(MIC)分别是:拟丝镰刀菌（Fusarium trichothecioides）2μL/mL、拟枝镰刀菌（Fusarium sporotrioides）1.25μL/mL、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）0.75μL/mL、腐皮镰刀菌（Fusarium solani var coeruleum）2μL/mL、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）1.5μL/mL。其中对蓝桉叶精油最为敏感的致病菌是:黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）和拟枝镰刀菌（Fusarium sporotrioides），经国内外文献检索，将蓝桉叶精油用于抑制马铃薯干腐病镰刀菌生长尚无报道。
　　蓝桉叶精油各主要单体组分对镰刀菌致病菌的抑制效果不同;α-松油醇和乙酸松油酯对拟枝镰刀菌（F.sporotrioides）具有较强的抑制作用，α-松油醇和桉叶油素对黄色镰刀菌(F.culmorum)具有较明显的抑制作用。实验表明蓝桉叶精油及其主要化合物对干腐病有共同抑制作用，可有效抑制镰刀菌的生长、繁殖，同时，也表明精油主份含量不完全正关联，并非其含量越高的成份抑菌的能力就越强，而与其他含氧单萜类化合物的含量有很大关联，其存在相互协同作用的抗菌能力。综合起来，α-松油醇对几种镰刀菌均有良好的抑制作用，这一事实为其他富含α-松油醇植物精油的利用提供借鉴，而将α-松油醇用于抑制马铃薯干腐病镰刀菌，经国内外文献检索也尚无相同的报道。
　　3.不同浓度的蓝桉叶精油处理接种于培养基中的镰刀菌和孢子悬浮液，能有效的控制致病菌菌丝和孢子的的生长，其中蓝桉叶精油对于拟枝镰刀菌(F.sporotrioides)和黄色镰刀菌（F.culmorum）的处理效果最好。体外试验发现蓝桉叶精油对马铃薯干腐病主要致病菌的菌落结构、菌丝生长和饱子的萌发上都有明显的抑制作用。运用扫描电镜观察发现，经蓝桉叶精油处理后菌丝在形态上发生变化，更多地表现在菌丝过度扭曲、缠绕，菌丝呈现萎焉、干瘪、缩皱、出现不规则加厚或断裂、变形等异常形态学变化。经光学显微镜观察发现，蓝桉叶精油处理后，镰刀菌孢子萌发受到抑制，表现为孢子芽管短小或畸形、孢子透明形成空泡。随着精油浓度的不断增加，镰刀菌菌丝细胞受到损坏的程度也会越大，菌丝体的解体也会越严重，导致原生质体泄露，镰刀菌电导率和丙二醛的值都升高，坏死菌丝和孢子数量增加，表明蓝桉叶精油处理能够使菌丝形态改变、结构破坏，最终使致病菌死亡。
　　4.蓝桉精油及其组分对马铃薯干腐病致病菌镰刀菌DNA作用的研究。蓝桉叶精油及其主要单体化合物对干腐病致病菌的抑制作用在分子水平上有无差异，通过凝胶电泳和紫外分光光度法检测其DNA的表达变化，实验结果显示:经精油及主要单体化合物处理后的拟枝镰刀菌（F.sporotrioides）和黄色镰刀菌（F.culmorum）总DNA的含量和浓度都有所下降，对照组拟枝镰刀菌(F.sporotrioides)DNA的总量为1.29μg，经蓝桉叶精油、松油醇和乙酸松油酯处理后的DNA总量分别为:1.09、1.00和1.06μg;对照组黄色镰刀菌（F.culmorum）DNA的总量为1.22μg，显著高于其他精油及单体处理菌丝后的DNA含量，说明蓝桉叶精油及其单体组分能够对镰刀菌菌丝体内DNA的合成起到干扰和抑制作用，凝胶电泳的检测结果同样表明，蓝桉叶精油、松油醇、乙酸松油酯、冰片、桉叶油素和α-蒎烯的条带清晰度和带型亮度都没有对照组的清晰明亮。说明干腐病致病菌DNA的复制以及指导蛋白质的合成方面受到精油的损坏，使其无法正常的完成菌体的代谢，从而使致病镰刀菌受到抑制。
　　综上所述，本文利用酶预处理-无溶剂真空微波辅助法提取蓝桉叶精油，提取到的精油在保证提高其精油的总得率和各单体成分特性的前提下，处理干腐病致病菌，实验证明，蓝桉叶精油及其主要单体化合物，有效抑制了马铃薯干腐病致病菌镰刀菌的生长及其繁殖，降低了孢子的萌发率，使其对马铃薯的损害作用减小。在研究精油通过损伤镰刀菌细胞膜进入细胞后的作用时，由扫描电镜和光学显微观察到菌丝、孢子形态发生的畸变，表明精油对其内部造成损伤，在分子水平上，通过凝胶电泳观测到蓝桉叶精油使镰刀菌合成DNA的表达量下降，说明在该水平上DNA也有损伤及影响。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 植物精油的国内外研究进展

1．2．1 植物精油的研究概况

1．2．2 植物精油成分的分析鉴定方法

1．2．3 植物精油的提取方法

1．2．4 植物精油的体外抑菌活性的实验方法

1．2．5 植物精油的抑菌研究

1．3 蓝桉精油的国内外研究进展

1．3．1 蓝桉精油研究概况

1．4 马铃薯干腐病的国内外研究进展

1．4．1 马铃薯干腐病的症状

1．4．2 马铃薯干腐病的发病规律

1．5 本项目的研究目的意义及内容

1．5．1 研究目的意义

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

2 酶预处理-无溶剂真空微波法提取蓝桉精油

2．1 引言

2．2 实验仪器与材料

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验仪器与试剂

2．3 试验方法与步骤

2．3．1 酶预处理提取

2．3．2 无酶预处理的真空微波提取

2．3．3 单糖种类和含量的变化

2．3．5 酶预处理-无溶剂真空微波辅助提取单因素实验

2．3．6 响应面优化

2．4 结果与讨论

2．4．1 酶预处理后加入酶活化剂微波提取蓝桉精油分析

2．4．2 酶预处理后无活化剂微波提取蓝桉精油分析

2．4．4 无酶预处理的真空微波提取蓝桉精油分析

2．4．5 酶预处理-真空微波提取蓝桉精油分析

2．4．6 酶预处理前后蓝桉叶单糖种类和数量的变化

2．4．7 酶预处理-无溶剂真空微波辅助提取单因素实验

2．4．8 响应面优化提取工艺参数

2．5 本章小结

3 蓝桉叶精油对马铃薯致病菌镰刀菌抑制活性的研究

3．1 引言

3．2 实验仪器与材料

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验菌种

3．2．3 培养基

3．2．4 主要仪器及试剂

3．3 试验方法与步骤

3．3．1 菌悬液的制备

3．3．2 蓝桉叶精油对马铃薯致病菌镰刀菌的抑菌效果

3．3．3 蓝桉叶精油对镰刀菌最低抑菌浓度(MIC)

3．3．4 蓝桉叶精油对镰刀菌最低杀菌浓度(MBC)

3．3．5 蓝桉叶精油对镰刀菌敏感菌株的时间至死(Time-kill)

3．4 结果与讨论

3．4．1 蓝桉叶精油对马铃薯致病菌镰刀菌抑菌效果分析

3．4．2 蓝桉叶精油对镰刀菌的最低抑菌浓度(MIC)分析

3．4．3 蓝桉叶精油对镰刀菌的最低杀菌浓度(MBC)分析

3．4．4 蓝桉叶精油对镰刀菌敏感菌株的时间至死(Time-kill)分析

3．5 本章小结

4 蓝桉叶精油主要单体对马铃薯致病菌镰刀菌抑制活性的研究

4．1 引言

4．2 实验仪器与材料

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验菌种

4．2．3 培养基

4．2．4 主要仪器及试剂

4．3 试验方法与步骤

4．3．1 菌悬液的制备

4．3．2 蓝桉叶精油主要单体对镰刀菌最低抑菌浓度(MIC)

4．3．3 蓝桉叶精油主要单体对镰刀菌最低杀菌浓度(MBC)

4．4．1 蓝桉叶精油主要单体对镰刀菌最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓(MBC)分析

4．4．2 蓝桉叶精油主要单体化合物桉叶油素和α-松油醇联合抑菌分析

4．5 本章小结

5 蓝桉叶精油和主要单体对马铃薯致病菌镰刀菌抑制作用的研究

5．1 引言

5．2 实验仪器与材料

5．2．1 实验菌种

5．2．2 主要仪器

5．2．3 实验材料与试剂

5．3 实验方法与步骤

5．3．1 蓝桉叶精油及主要单体化合物对镰刀菌敏感菌株扫描电镜观察

5．3．2 蓝桉叶精油及其主要单体化合物对镰刀菌孢子萌发的影响

5．3．3 蓝桉叶精油对镰刀菌细胞膜渗透性的影响

5．3．4 蓝桉叶精油对镰刀菌菌丝脂质过氧化的影响

5．3．5 真菌菌丝体DNA提取

5．4 结果与讨论

5．4．1 蓝桉叶精油和主要化合物对黄色镰刀菌(F．culmorum)扫描电观察分析

5．4．2 蓝桉叶精油和主要化合物对拟枝镰刀菌(F．sporotrioides)扫描电镜观察分析

5．4．3 蓝桉叶精油对镰刀菌致病菌孢子萌发的分析

5．4．4 蓝桉叶精油对镰刀菌孢子萌发的光学显微镜观察分析

5．4．5 蓝桉叶精油对镰刀菌细胞膜通透性的分析

5．4．6 蓝桉叶精油对镰刀菌菌丝脂质过氧化的分析

5．4．7 蓝桉叶精油对马铃薯干腐病致病菌镰刀菌DNA含量分析

5．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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