舞毒蛾Methuselah-like受体激动剂性肽功能分析

摘要

舞毒蛾（Lymantria dispar）是一种世界性的害虫，对森林造成严重的危害。目前对舞毒蛾的防治仍以化学防治为主，而其导致的“3R”问题亦不容忽视。因此，寻找新的分子作用靶标来创制新型杀虫剂进行无公害防治具有重要意义。研究报道Mth受体对一系列外界胁迫因素（饥饿、高温、氧化）的耐受性显著增强。昆虫Mth受体的结构功能、信号转导通路的研究，为揭示生物衰老机制提供了新的途径，而其内源性配体研究将为研究Mth受体的功能和新杀虫剂靶标的创制打开新思路。
　　本研究以亚洲型舞毒蛾为对象，克隆Mthl受体内源性配体性肽（Sex Peptide，命名为LdSP）基因，并对LdSP基因进行生物信息学分析，利用RNAi技术和转基因果蝇技术分析LdSP基因对昆虫生长发育、新陈代谢及抗逆性的影响。具体研究结果如下:
　　1、成功从舞毒蛾转录组文库中筛选1个Methuselah-like受体内源性配体基因序列，并克隆LdSP基因全长。LdSP基因的阅读框(ORF)长度为1263bp，编码420个氨基酸，蛋白质分子量为48.79kDa，pI为8.79，为碱性蛋白，不含信号肽，LdSP蛋白具有G蛋白偶联受体家族成员基本的7-跨膜受体结构(7-TM)，属GPCRs B家族成员。
　　2、LdSP基因在舞毒蛾各个发育阶段表达不同，卵期LdSP基因的表达量高于其它发育阶段（除4龄、6龄、蛹），其中在幼虫期随龄期增长表达量交替变化;6龄时LdSP基因的表达量达到峰值，蛹期表达量仅是6龄的8.80％;而雌雄成虫表达量差距很大，雌成虫LdSP基因表达量为雄成虫的5.41倍，推测LdSP基因与调控舞毒蛾龄期变化、化蛹以及雌成虫产卵功能有关。
　　3、dsRNALdSP处理120h基因沉默效果最为显著，沉默效率达到48.10％，为对照组(dsRNAGFP)的240.5倍。在各个时间点，LdSP基因沉默舞毒蛾鲜重累计增长率均低于对照组（DEPC和dsRNA GFP），且相对生长率、食物利用率、食物转化率也均略低于对照，而在相对取食量和近似消化率却高于对照组，推测LdSP基因影响舞毒蛾幼虫的生长发育和代谢调控。高温胁迫下，LdSP基因沉默组的死亡率均高于对照组，平均死亡时间为104.80h，分别为DEPC的71.62％和dsRNAGFP的80.62％。饥饿胁迫下，在各个时间点LdSP基因沉默组的死亡率均高于对照组，平均死亡时间为120.67h，分别为DEPC的89.65％和dsRNAGFP的93.11％;百草枯氧化胁迫下，LdSP基因沉默组的LC10、LC30和LC50均显著小于对照组DEPC和dsRNAGFP，同时处理组LC30胁迫下LdSP基因沉默舞毒蛾死亡率分别为dsRNAGFP的1.91和DEPC的2.38倍。LdSP基因沉默后，舞毒蛾幼虫的高温、饥饿和氧化抗逆性降低，表明LdSP基因可增强舞毒蛾抗逆性。
　　4、成功构建了重组转基因质粒pUAST-LdSP;采用显微注射技术将重组质粒pUAST-LdSP导入果蝇胚胎，获得转LdSP基因果蝇品系。表达LdSP基因果蝇品系的平均寿命、半数死亡天数和最高寿命显著高于对照组(W1118和DB)，分别延长了45.55％和58.72％、22.89％和40.85％、13.79％和32.00％。高温(36℃)胁迫下，在各个时间点的存活率，转LdSP基因果蝇品系＞W1118＞DB，平均死亡天数与W1118接近，为对照果蝇DB的1.19倍，最终死亡时间点远大于W1118和DB;饥饿前期，转LdSP基因果蝇品系的平均死亡天数为48.59h，分别W1118和DB品系的1.12和1.27倍;百草枯氧化胁迫下，转LdSP基因果蝇品系的LC10、LC30和LC50均高于W1118和DB，百草枯LC30胁迫转LdSP基因果蝇品系，转LdSP基因果蝇品系死亡率低于W1118和DB果蝇品系，分别对照的54.21％和65.22％。LdSP参与调控果蝇寿命、生长发育和抗逆性。
　　这些研究结果表明舞毒蛾长寿基因Methuselah-like受体内源性配体LdSP基因参与昆虫生长发育、新陈代谢、寿命和抗逆性的调控，研究结果丰富了昆虫SP基因的功能，这将有助于更好地认识其他昆虫GPCR B家族成员及其相关激动剂;同时为挖掘新作用靶标以及创制杀虫剂防治害虫提供了理论依据和新途径。

目录

摘要

1 绪论

1．1 昆虫Methuselah-like受体及其激动剂研究进展

1．2 RNAi技术在昆虫中的研究进展

1．3 转基因果蝇技术的研究进展

1．4 舞毒蛾研究进展

1．5 本论文研究目的及意义

2 舞毒蛾Methuselah-1ike受体激动剂性肽基因鉴定及特性分析

2．1 试验材料

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 实验仪器

2．1．3 主要试剂(盒)

2．2 试验方法

2．2．3 反转录合成第一链cDNA

2．2．4 LdSP基因全长载体构建

2．2．5 PCR检测及胶回收

2．2．6 LdSP基因生物信息学分析

2．2．7 不同发育阶段舞毒蛾LdSP基因表达量分析

2．3 结果与分析

2．3．1 RNA提取和消化

2．3．2 LdSP基因克隆

2．3．3 LdSP基因特性分析

2．3．4 舞毒蛾LdSP基因不同发育阶段表达

2．4 小结与讨论

2．4．1 舞毒蛾LdSP基因鉴定与分析

2．4．2 舞毒蛾LdSP基因发育特异性表达分析

3 RNAi介导舞毒蛾性肽LdSP基因功能分析

3．1 试验材料

3．1．1 供试昆虫

3．1．2 实验仪器

3．1．3 主要试剂(盒)

3．2 研究方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 含T7启动子序列模板的制备

3．2．3 dsRNA的合成

3．2．4 舞毒蛾LdSP基因沉默效率检测

3．2．5 显微注射及累计增长率和营养指标检测

3．2．6 LdSP基因沉默舞毒蛾抗逆性分析

3．3 结果与分析

3．3．1 含有T7启动子的质粒模板的PCR检测

3．3．2 dsRNA合成电泳检测

3．3．3 基因沉默效率分析

3．3．4 LdSP基因沉默对幼虫生长发育及表型影响

3．3．5 LdSP基因沉默舞毒蛾抗逆性分析

3．4 小结与讨论

4 转基因果蝇介导LdSP基因功能分析

4．1 试验材料

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 主要试剂

4．2 研究方法

4．2．1 转基因果蝇载体构建

4．2．2 转基因果蝇的建立与检测

4．2．3 转基因果蝇表型及验证

4．2．4 转LdSP基因果蝇对生长发育的影响

4．2．5 转LdSP基因果蝇抗逆性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 转LdSP基因果蝇载体构建

4．3．2 转LdSP基因果蝇表型及目的基因检测

4．3．3 转LdSP基因果蝇对其生长发育的影响

4．3．4 转LdSP基因果蝇抗逆性分析

4．4 小结与讨论

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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