应用代谢组学研究长春花响应机械损伤的代谢基础

摘要

植物在生存过程中会面临极其复杂的生态环境，其中机械损伤在植物体生命周期中是一种持续不断的威胁。植物受损后所造成的裸露伤口不仅会破坏植物体组织和器官的完整性，也是病原菌潜在侵入的威胁点。机械受损后还会导致植物体内发生一系列生理生化改变，诱发代谢调控，从而影响植株的正常生长。抗性较弱的个体还会发生代谢紊乱甚至死亡。植物外在生长状态往往源于其体内代谢的调节和变化。为了探究植株不同部位遭受机械损伤后在代谢水平上对损伤胁迫的响应，本研究以次生代谢模式植物长春花(Catharanthus roseus)为材料，利用GC-MS/MS非靶向和LC-qTOF-MS靶向代谢组学技术相结合的手段，针对植株上位叶、下位叶和根三个部位进行机械损伤处理后不同时序下各组织部位在初级和次级代谢水平上的特异性响应进行比较。本论文的主要研究内容及结果如下:
　　1.利用GC-MS/MS技术通过非靶标无偏向性检测方法共获得283个化合物，经不同处理组Q值时间筛选分析选定lh为强烈响应时间点，并通过模式识别方法PCA和PLS-DA分析获得52个显著差异代谢物，其中糖类30个，氨基酸2个，醇类6个，酸类8个，脂类2个，它们都是长春花在不同部位遭受机械损伤时发生重大代谢变化的初级代谢产物。并被KEGG富集到3个主途径:糖类代谢(Carbohydrate metabolism)、脂肪酸类代谢(Fatty acid metabolism)和氨基酸类代谢(Amino acid metabolism)，9个分支途径，糖类代谢5个:半乳糖代谢(Galactose metabolism)、淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolites)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、果糖和甘露糖代谢(Fructose and mannose metabolism)和氨基糖与核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)，脂肪酸类代谢2个:脂肪酸生物合成(Fatty acid biosynthesis)和不饱和脂肪酸生物合成(Biosynthesis of unsaturated fatty acids)，氨基酸类代谢2个:赖氨酸降解(Lysine degradation)和苯丙氨酸代谢(Phenylalanine metabolism)。受损后各处理组植株的初级代谢应答都以糖类代谢为主。相对于对照组(Control check group，CK组)，下位叶机械损伤处理组(Wounded lower leaf group，WLL组)代谢合成被显著刺激，酸类代谢物响应快速，在处理组中响应最为强烈。共有20个组间差异代谢物参与上位叶机械损伤胁迫，其中糖类11个，酸类2个，脂肪酸类2个，醇类4个;KEGG富集了7个代谢通路，其中糖类4个。上位叶机械损伤处理组(Wounded upper leaf group，WUL组)响应次之，有18个组间差异代谢物，其中糖类10个，酸类3个，脂类2个，醇类2个，氨基酸1个;富集代谢通路5个，糖类代谢物消耗较大。根机械损伤处理组(Wounded root group，WR组)最弱，共获得18个组间差异代谢物，糖类10个，酸类3个，醇类4个，氨基酸类1个，富集3个代谢通路;其中非糖类代谢物主要在地上部分被显著合成，而大部分糖类代谢物显著降低。
　　2.基于LC-qTOF-MS建立了一个包含39种酚类化合物(Phenolic compounds，PCs)在内的酚类定性库。不同处理组Q值筛选以3h为最佳响应时间点。经过PLS-DA(VIP＞1和P＜0.05)分析共获得12个显著差异代谢物:肉桂酸(Cinnamic acid)、儿茶素(Catechin)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(Quercetin-3-O-rhamnoside)、大豆苷元(Daidzein)、原儿茶酸(3-4-Hydroxybenzoic acid)、橙皮苷(Hesperidin)、木犀草素(Luteolin)、甘草素(Liquiritigenin)、芹菜素(Apigenin)、异甘草素(Lsoliquiritigenin)、染料木素(Genistein)和杨梅苷(Myricetin)，并以此为基础深入对比不同处理组各组织部位间差异代谢物的应答响应。在WUL组PCs合成前体物质苯丙氨酸(L-Phenylalanine)只在上位叶中显著积累，下游大豆苷元代谢通路甘草素和大豆苷元，木犀草素代谢通路木犀草素，代谢物杨梅苷，染料木素和橙皮苷均显著参与上位叶机械损伤应答。WLL组中苯丙氨酸在各组织部位均显著下降，其中大豆苷元代谢通路中甘草素，木犀草素代谢通路木犀草素，代谢物原儿茶酸、槲皮素-3-O-鼠李糖苷及橙皮苷积极应答下位叶机械损伤胁迫。相对于其它处理组，WR组在PCs代谢水平上响应最弱。只有大豆苷元整条代谢通路，木犀草素代谢通路木犀草素和代谢物杨梅苷共同完成了根损伤后的机械胁迫应答。
　　3.利用LC-MS建立了一个可检测7种萜类吲哚生物碱(Terpenoid indole alkaloids，TIAs)在内的TIAs定量测定方法，不同处理组时间响应Q值筛选5h为最佳应答时间。与PCs应答存在时序差异。经过PLS-DA(VIP＞1和P＜0.05)有监督方法分析共获得马钱苷(Loganin)、色胺(Tryptamine)、蛇根碱(Serpentine)和长春碱(Vinblastine)4个显著差异代谢物。进一步对其在各处理组组织部位差异积累进行分析，其中马钱苷和蛇根碱响应最为明显。在WUL组中马钱苷和蛇根碱都直接参与了上位叶损伤应答;WLL组中只有蛇根碱显著参与下位叶损伤应答;而在WR组中马钱苷和蛇根碱的合成都受到了不同程度的合成障碍。此外长春碱在不同处理组中都只在茎中显著积累，还处于响应准备阶段。
　　机械损伤会普遍刺激植株能量供应来源初级代谢响应的升高，为次级代谢应答提供充足的能量和原料基础。TIAs和PCs作为长春花两类重要的次级代谢产物，既会共同抵御外界的机械损伤，也会存在对初级代谢原料的相互竞争。通过共同的前体物质分支酸(Chorismic acid)分别进入以苯丙氨酸途径为主的PCs合成途径和以色氨酸途径为限制因素的TIAs合成途径，从而共同完成机械损伤胁迫应答。PCs与TIAs在应答响应上存在时序差异。经源-库模型及资源分配权衡，各处理组均以PCs代谢作为主要的机械损伤胁迫响应物质，其中WLL组采取抵御型策略，WUL组采取偏重抵御的抵御-耐受型策略，WR组则采取耐受型策略。
　　本研究首次运用靶向LC-qTOF-MS和非靶向GC-MS/MS相结合代谢组学技术从代谢网络水平上对比了上位叶、下位叶和根机械损伤后，长春花初级和次级代谢的响应差异。并以源-库模型和资源权衡为基础探讨了受损后植株各组织部位时序变化下次级代谢防御系统的响应机制。揭示了长春花3种不同机械损伤应答方式和防御病菌入侵模式的差异，为植物响应机械损伤提供了细致全面的理论依据和实践基础。同时对于利用代谢工程进行植株抗损伤能力及品种改良方面有深远意义。并为解决由干扰因子介入所导致的常见逆境胁迫等生态问题提供了一种新型、高效的技术手段。

目录

摘要

1 绪论

1．1 机械损伤

1．1．1 机械损伤对植物的伤害

1．1．2 植物对机械损伤的应答

1．2 代谢组学

1．2．1 代谢组学简述

1．2．2 代谢组学的研究流程

1．2．3 代谢组学主要技术手段

1．2．4 代谢组学在植物研究中的应用和发展

1．3 长春花

1．3．1 长春花生物学特性

1．3．2 长春花次级代谢产物及代谢途径

1．4 本研究的目的与意义

2 实验材料与研究方法

2．1 材料选择

2．1．1 生理参数的测量

2．1．2 初级代谢产物的检测和筛选

2．1．3 生物碱定量测定方法的建立和检测

2．1．4 数据统计与分析

2．1．5 筛选结果

2．2 研究内容与实验路线

2．3 实验处理

2．4 初级代谢产物的检测和筛选

2．5 酚类代谢库的建立和检测

2．5．1 酚类代谢库的建立

2．5．2 酚类化合物的检测

2．6 生物碱含量测定方法的建立和检测

2．7 关键代谢物相关酶基因的表达

2．7．1 总RNA提取

2．7．2 cDNA合成

2．7．3 qRT-PCR反应

2．8 时间筛选与各组织部位分析

2．8．1 时间筛选

2．8．2 各组织部位分析

2．9 数据统计与分析

3 长春花三种不同部位机械损伤后在初级代谢水平上的响应和对比

3．1 引言

3．2 结果与分析

3．2．1 上位叶处理组各组织部位在初级代谢水平上对机械损伤的响应

3．2．2 下位叶处理组各组织部位在初级代谢水平上对机械损伤的响应

3．2．3 根处理组各组织部位在初级代谢水平上对机械损伤的响应

3．3 讨论

3．4 本章小结

4 长春花三种不同部位机械损伤后在酚类代谢水平上的响应和对比

4．1 引言

4．2 结果与分析

4．2．1 上位叶处理组各组织部位在酚类代谢水平上对机械损伤的响应

4．2．2 下位叶处理组各组织部位在酚类代谢水平上对机械损伤的响应

4．2．3 根处理组各组织部位在酚类代谢水平上对机械损伤的响应

4．3 讨论

4．4 本章小结

5 长春花三种不同部位机械损伤后在生物碱代谢水平上的响应和对比

5．1 引言

5．2 结果与分析

5．2．1 上位叶处理组各组织部位在生物碱代谢水平上对机械损伤的响应

5．2．2 下位叶处理组各组织部位在生物碱代谢水平上对机械损伤的响应

5．2．3 根处理组各组织部位在生物碱代谢水平上对机械损伤的响应

5．2．4 生物碱代谢与酚类代谢对机械损伤响应对比

5．3 讨论

5．4 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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