毛果杨FLA基因家族分析及PtrFLA31/34基因双突变体创制

摘要

束状阿拉伯半乳聚糖(Fasciclin-like arabinogalactan proteins，FLAs)是阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan proteins，AGPs）的一个超家族，定位于细胞表面，存在于细胞壁质膜或胞外基质中，暗示了其在植物生长发育中由很重要的作用，然而它们的功能还未知。据推测，FAS结构域是细胞粘附结构域，广泛存在于生物体中，但是FAS结构域和高度糖基化的AGP区域同时存在的情况是在植物中独有的。
　　已有研究表明FLAs在植物生长发育过程中起着重要作用。本文利用生物信息学、半定量PCR和CRISPR/Cas9技术等分子生物学方法，对毛果杨中FLA家族成员进行识别鉴定，并对PtrFLA31和PtrFLA34的功能进行了研究。其结果如下:
　　分别以21个拟南芥FLA家族成员氨基酸序列，在毛果杨基因组数据库中进行同源性检索，并结合fasciclin和fasciclin-like关键词检索，结果表明毛果杨FLA家族共有46个成员，其氨基酸长度从210到446个。SMART网站预测38个成员有1个Fas结构域，8个成员有2个Fas结构域。SignalP4.1预测39个tr FLA成员预测有信号肽，big-PI网站预测27个成员有GPI锚。
　　FAS结构域高度保守，用ClustalX2.0软件对FAS结构域进行比对分析，发现和其它植物一样，含有高度保守的H1、H2（大约10个氨基酸），根据Pfam数据库，[Tyr/Phe]-His(YH motif)在H1和H2之间，并且比拟南芥FLA家族FAS结构域更为保守。
　　用MEGA6.0对毛果杨和拟南芥进FLA家族成员进行进化分析，之前有研究表明拟南芥FLA家族成员可以被分为四个亚类(A-D)，本研究表明毛果杨FLA家族成员也分为四个亚类，其中A亚类成员最多(27个)，B、C、D亚类成员分别为6、7、6个。草本植物拟南芥A亚类成员只有6个，暗示该亚类可能跟木材的次生发育有关。
　　A亚类成员都是含有一个FAS结构域两侧都有AGP-like糖基化位点。对FLA家族中A亚类的成员进行半定量PCR分析，发现该组成员在木质部都有高丰度表达，在茎节的第一二节由微量表达，第三到十节表达量升高。且除了PtrFLA3和PtrFLA21在所有组织的表达量都很高外，其余成员在木质部特异性表达。
　　PtrFLA31和PtrFLA34的结构都是一个FAS结构域的两侧含有糖基化位点。且根据进化树，两者属于同一个小簇，也意味着两者间的序列很相似。基于CRISPR/Cas9技术创制毛果杨PtrFLA31/34基因双突变载体。观察转基因植株的表型发现:和野生型植株相比，突变体生长得更快，且突变体的叶子较为细长。

目录

摘要

1 绪论

1．1 引言

1．2 细胞壁

1．2．1 细胞壁的分子组织和相互作用

1．3 FLAs及其结构功能

1．3．1 AGPs及其结构

1．3．2 FLA及其功能

1．3．3 应拉木

1．4 基因编辑

1．4．1 CRISPR／CAS系统介绍

1．4．2 CRISPR／CAS系统的结构

1．4．3 CRISPR／CAS系统的应用

1．5 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 植物材料

2．2 菌株与载体

2．3 实验仪器

2．4 所用试剂及培养基的配制

2．5 实验方法

2．5．1 FLA家族成员的识别

2．5．2 进化分析

2．5．3 FAS序列比对

2．5．4 植物基因组DNA的提取

2．5．5 植物各组织及茎节RNA的提取

2．5．6 首链cDNA的合成

2．5．7 引物设计

2．5．8 半定量RT-PCR分析

2．5．9 载饰构建

2．5．10 目的DNA片段胶回收

2．5．11 大肠杆菌转化

2．5．12 质粒提取

2．5．13 农杆菌转化

2．5．14 毛果杨遗传转化

3 结果与分析

3．1 毛果杨FLA家族成员识别

3．2 毛果杨PtrFLA家族成员结构域及进化研究

3．2．1 毛果杨PtrFLA家族fasciclin domain序列分析

3．2．2 毛果杨PtrFLA家族成员进化关系研究

3．3 毛果杨FLA家族成员表达结果

3．4 毛果杨PtrFLA31／34基因CAS9／gRNA载体构造

3．5 转CAS9／gRNA-PtrFLA31／34杨树及其分子鉴定

3．6 PtrFLA31／34基因编辑分析

3．7 毛果杨PtrFLA31／34基因突变体表型分析

4 讨论

5 结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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