柽柳ThASR3基因抗旱和耐盐功能的研究

摘要

脱落酸-成熟-胁迫响应蛋白(Abscisic acid-，stress-，and ripening-induced proteins，ASR)是广泛存在生物体中与渗透调节有关的家族蛋白，具有转录因子和LEA蛋白的基本特征，在调控植物抗逆性形成方面发挥着重要作用。本实验从柽柳转录组数据鉴定了一条胁迫响应基因，其具有一个典型的ABA/WDS结构域，属于植物脱落酸-成熟-胁迫响应蛋白基因，命名为ThASR3。该基因全长309bp，编码103氨基酸，编码蛋白质的分子质量为11.45kD，等电点为9.1。
　　利用实时荧光定量RT-PCR技术分析显示，该基因受高盐、干旱诱导上调表达，暗示ThASR3可能在柽柳抗旱耐盐过程中发挥重要作用。构建ThASR3基因的过表达载体，蘸花法转化拟南芥，获得T3代转基因株系。对野生型和转基因株系拟南芥进行NaCl和Mannitol胁迫处理，胁迫条件下转基因株系的根长、鲜重及长势都优于野生型株系，表明ThASR3基因能提高转基因拟南芥的耐盐性和耐旱性。在NaCl和Manntiol胁迫下，通过对WT、Line1和Line2的T3代纯合株系的DAB、NBT、Evans blue组织化学染色的抗逆能力分析，结果表明:在转基因植株中O2-·和H2O2最低，细胞膜完整性最好，说明ThASR3基因在拟南芥中过表达显著提高转基因植株的抗逆性。
　　构建了RNAi载体pFGC5941-ThASR3，并将pROKⅡ-ThASR3、pFGC5941-ThASR3及空pROKⅡ瞬时转化到柽柳中，分别获得过表达、抑制表达及对照柽柳转基因植株。对转基因柽柳进行NaCl及Mannitol胁迫。利用DAB、NBT及Evas Blue染色结果表明，在三种转基因植株中，过表达柽柳的O2-·和H2O2与抑制表达的植株相比，含量较少，且细胞膜损伤最严重。说明ThASR3基因在柽柳中过表达使转基因植株的抗逆性显著提高。测定三种转基因植株的POD和SOD活性、PRO含量、甜菜碱含量、可溶性糖含量、H2O2含量、MDA含量、离子渗透率等生理指标，结果显示过表达植株(OE)的H2O2含量、ROS含量和MDA含量相对最低，POD活性和SOD活性、甜菜碱含量、可溶性糖含量、PRO含量相对最高;RNAi植株的H2O2含量、ROS含量和MDA含量相对最高，POD活性和SOD活性、甜菜碱含量、可溶性糖含量、PRO含量相对最低。以上研究表明，ThASR3能够提高转基因植株活性氧(ROS)清除能力，降低细胞受损伤程度，从而提高植株的抗逆能力。
　　构建植物表达载体pBI121-GFP-ThASR3，利用基因枪技术瞬时转化洋葱表皮研究亚细胞定位，结果表明ThASR3蛋白在细胞核和细胞质均有表达。利用酵母双杂交技术研究ThASR3转录激活活性，结果表明在酵母中ThASR3无转录激活活性，同时也无法形成同源二聚体，推测其可能并不是作为一个转录因子发挥功能。在后续研究中拟构建盐和干旱胁迫下的柽柳酵母双杂交文库，筛选ThASR3的互作蛋白，进一步揭示ThASR3的在柽柳胁迫应答中的作用机制。

目录

摘要

1 绪论

1．1 前言

1．2．1 植物响应干旱胁迫的生理机制

1．2．2 植物响应盐胁迫的生理机制

1．3．2 ASR蛋白在植物逆境胁迫中的功能

1．4 研究技术路线

1．5 本研究的目的和意义

2 柽柳ThASR3基因克隆及表达模式分析

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌种与载体

2．1．3 常用试剂(盒)

2．1．4 药品及培养基制备

2．2 实验方法

2．2．1 柽柳ThASR3基因的克隆

2．2．2 柽柳ThASR3基因生物信息学分析

2．2．3 柽柳ThASR3基因在不同胁迫下的表达分析

2．2．4 柽柳ThASR3蛋白的亚细胞定位

2．3 结果与分析

2．3．1 柽柳ThASR3基因的克隆

2．3．2 柽柳ThASR3基因的生物信息学分析

2．3．3 柽柳ThASR3基因在不同胁迫下的表达模式分析

2．3．4 柽柳ThASR3蛋白的亚细胞定位

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 ThASR3基因的表达及功能分析

3．1 实验材料

3．1．4 主要药品和培养基的配制

3．2 试验方法

3．2．1 植物过表达载体pROKII-ThASR3及抑制表达载体pFGC5941-ThASR3的构建

3．2．2 转ThASR3基因拟南芥的获得

3．2．3 转ThASR3基因拟南芥抗逆能力分析

3．2．4 非生物胁迫下瞬时侵染柽柳苗的表达分析

3．2．5 非生物胁迫下瞬时侵染柽柳苗的组织化学染色

3．2．6 非生物胁迫下瞬时侵染柽柳苗的生理生化指标测定

3．3 结果与分析

3．3．2 植物抑制表达pFGC5941-ThASR3的构建

3．3．3 转基因拟南芥的抗逆功能研究结果

3．3．4 组织化学染色技术研究转基因拟南芥的ROS水平及细胞受损情况

3．3．5 瞬时侵染刚毛柽柳的抗逆功能研究结果

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 ThASR3蛋白转录激活活性的研究

4．1 实验材料

4．1．3 药品和培养基配制

4．2 实验方法

4．2．1 ThASR3蛋白转录激活活性的研究

4．2．2 ThASR3蛋白同源二聚化的分析

4．3．1 ThASR3蛋白转录激活活性的研究

4．3．2 ThASR3蛋白同源二聚化分析

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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