眼球破裂伤视网膜病变的实验研究

摘要

背景和目的:眼球破裂伤常造成严重视力下降或视力丧失，损伤机制尚不十分清楚。本研究利用汽枪枪弹制做兔眼球破裂伤模型，观察兔眼球破裂伤后视网膜早期的临床表现、病理变化，并初步分析眼球破裂伤后视网膜细胞内RNA的表达情况、视网膜细胞的凋亡情况和视网膜细胞的肿胀坏死情况。 材料与方法:健康无眼疾新西兰白兔48只，眼前段及视网膜检查正常，体重为2.5～3.0kg。随机分为正常对照、伤后1h、3h、6h、12h、24h共6组，每组8只。家兔麻醉后，用自制汽枪自兔耳根后缘与眼球正中连线的角膜缘内1mm沿角膜平面射击，汽枪子弹从面鼻根部射出，形成眼球破裂伤模型。于伤后1h、3h、6h、12h、24h处死实验兔，立即摘除眼球。切除角膜后以4％多聚甲醛磷酸缓冲液固定24h，逐级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋备用。将包埋好的眼球标本，平行于视神经矢状轴且以其为平面的视网膜进行连续切片6张，切片厚度为4μm，每2张分别行HE染色、甲基绿-派罗宁-马休黄(MG-P-MY)染色法行细胞RNA检测、TUNEL法细胞原位凋亡检测。HE染色和MG-P-MY染色组织切片行光镜及超高倍显微镜观察(ACT-2000型超高倍显微诊断系统)。光镜下观察：MG-P-MY染色RNA阳性表达和TUNEL细胞凋亡阳性表达图像经过高清晰彩色病理图像分析系统(HPISA-1000)处理(每张切片取4个视野)，计算视野中阳性染色的细胞数，分析视网膜组织中RNA阳性和TUNEL阳性细胞情况。应用SPSS11.5统计软件，进行变量转换，单因素方差分析和相关分析。 结果:1.临床表现汽枪弹击伤兔眼后见伤眼球结膜立即充血、水肿、角膜伤口可见房水溢出，虹膜、晶体脱出，1分钟内见球内出血自伤口处溢出。 2.病理检查HE染色光镜及超高倍显微镜观察：所有伤眼可见脉络膜上腔出血，玻璃体内可见大量红细胞，视网膜脱离，偶见浅层巩膜出血、睫状体与巩膜分离。1h～3h组视网膜感光细胞的锥杆层有碎裂改变。6h～12h组见神经节细胞肿胀、固缩等改变，视网膜内核层明显空泡变性。24h组视网膜变薄、结构紊乱。 3.MG-P-MY染色检测细胞RNA表达情况对照组和1h组视网膜各层细胞内均未见RNA阳性表达，3h组在内核层及神经节细胞层有少量RNA阳性表达，6h内核层阳性表达增多，外核层偶见阳性表达，12h阳性表达明显，24h可见大量RNA阳性细胞。对照组和各实验组RNA阳性细胞比例以凋亡指数(AIP)表示。凋亡指数(AIP)统计结果：对照组与实验各组经方差齐性检验，方差不齐，经平方根变量变换后，方差齐性检验(P＜0.01)，方差齐；经单因素方差分析，对照组与伤后1h组差别有显著性(P=0.033)；伤后1h与3h组差别有显著性(P=0.042)；伤后12h与24h组比较无显著性差别(P=0.570)；其它各组之间比较有显著性差异(P＜0.01)。 超高倍镜下观察可见三种细胞：大小、形态正常核绿染的正常细胞；大小正常或变小淡红染的凋亡细胞；细胞肿胀染色质呈网状绿染的坏死细胞。对照组和1h组未见肿胀坏死细胞，3h时出现肿胀坏死细胞，6h肿胀坏死细胞数达高峰，12h组有所下降。对照组和各实验组肿胀坏死细胞比例以胀亡指数(OI)表示。各实验组胀亡指数比较：对照组与1h组差别无显著性(P=0.470)，1h组与24h组差别无显著性(P=0.064)，3h与12h组差别无显著性(P=0.141)；对照组与24h组(P=0.12)、3h与24h组(P=0.08)差别无显著性，其它各组之间比较有显著性差异(P＜0.01)。 凋亡细胞(RNA阳性)和肿胀坏死细胞的比较：从其各占细胞总数的比例来看，在受伤6h以前(含6h)胀亡细胞所占的比例大于凋亡细胞；在受伤12h以后(含12h)凋亡细胞所占的比例要大于胀亡细胞，而且随着时间的延长，肿胀坏死细胞有下降趋势，而凋亡细胞在12h后虽小幅升高但趋于稳定。 4.TUNEL法检测细胞凋亡对照组视网膜组织中未见凋亡细胞。实验组伤后1h-3h组视网膜组织中仅发现极少凋亡细胞；伤后6h后在视网膜内核层和神经节细胞层凋亡细胞显著增加；伤后12h-24h在内核层可见大量凋亡细胞，外核层也出现凋亡细胞。对照组和各实验组TUNEL阳性细胞比例以凋亡指数(AIT)表示。凋亡指数(AIT)统计结果对照组与实验各组经方差齐性检验，方差不齐，经平方根变量变换后，方差齐性检验(P＜0.01)，方差齐；经单因素方差分析，对照组与伤后1h组差别无显著性(P=0.291)；伤后1h与3h差别无显著性(P=0.101)；伤后12h与24h比较有显著性差异(P=0.038)；其它各组之间比较有显著性差异(P＜0.01)。 凋亡指数(AIP)与凋亡指数(AIT)的相关性分析：二者有明显相关性，r=0.888(P＜0.01)。 结论:本研究运用汽枪制做眼球破裂伤模型，伤情基本一致，制做简单、重复性好，便于对比研究，是眼球破裂伤理想的动物模型。眼球破裂伤伤情非常严重，光镜下视网膜在6h出现明显病理改变，12-24h视网膜损伤进一步加重。伤后3h视细胞内即有RNA表达，伤后6h视细胞内见TUNEL阳性细胞，视细胞内RNA表达与视细胞凋亡密切相关，用于反映视细胞凋亡情况时较TUNEL法更早、更敏感。MG-P-MY染色结合超高倍镜观察，可准确分辨正常、凋亡和肿胀坏死细胞，为研究视网膜损伤时凋亡和肿胀坏死的情况提供了一个可靠、直观、快速的方法。

目录

郑重声明

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

附图

参考文献

细胞凋亡、胀亡与视网膜损伤

致谢