人IFN-β基因复制缺陷型腺病毒载体的构建

摘要

干扰素是第一个被用于临床治疗人类肿瘤的细胞因子，在体内和体外试验中其抗增生和免疫调节作用是毋庸置疑的。在针对多种肿瘤的研究中，Ⅰ型干扰素尤其是IFNβ的抗肿瘤增殖作用更为明显.国内外的基础研究正从分子水平试图揭示其复杂的直接作用或协同调节的机制，但是，更多的目光还是投向了对其生物学作用的利用上。生理条件下，许多体内的细胞因子低度表达，由于机体的自稳系统而受到严格的分泌调控，并且这些细胞因子的半衰期极短，蛋白清除率较高，所以血药浓度很低，IFNβ也不例外；但是治疗作用的IFNβ血药浓度较高，如果人为的静脉给药使血药浓度增高到最大耐受剂量，由于以上原因，血药浓度水平不仅不能维持稳定，而且会导致极大的系统毒副作用，无法达到抗增生作用。提高局部药物浓度能够解决这一问题。 腺病毒载体是一个相对成熟的病毒载体，国外早已用腺病毒载体开展了Ⅲ期临床试验，并在单基因遗传性疾病和某些肿瘤的治疗中凸显疗效。早期的腺病毒载体存在着较强的免疫原性，且由于腺病毒呈一过性表达，需要反复使用，存在发生严重免疫反应的可能性；另外包装过程中复制型病毒的产生也给临床应用带来风险。但现在腺病毒构建的方法和载体本身已经被多次优化，和其他载体比较，其优点已超过其局限性。 在我国处于肿瘤发病率逐年增高的形势下，我们希望通过构建IFNβ的腺病毒载体，结合前期对骨髓间质干细胞的研究，找到一个合适的、能够富集于肿瘤局部发挥IFNβ生物学作用的肿瘤疫苗，为促进其早日成为安全高效的肿瘤治疗药物奠定基础。 材料与方法 1从健康人外周血中提取出基因组DNA，以此为模版，用pyrobestTaq酶PCR法扩增出hIFNβ基因片段。将目的基因克隆入中间载体pMD-18T载体，经蓝白筛选和PCR筛选后测序，证实序列无误； 2酶切出目的基因并将之克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中，将新形成的pAdTrack-CMV-hIFNβ用限制性内切酶PmeⅠ线性化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌株BJ5183细胞中。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-hIFNβ； 3内切酶pacⅠ再次将重组子线性化，脂质体转染细胞株HEK293。借助GFP的表达可以跟踪观察包装病毒Ad-hIFNβ的产生。重组腺病毒载体感染293细胞进行病毒扩增，经过四次扩增，纯化后，用空斑形成实验法测定病毒滴度；4RT-PCR法证实hIFNβ基因. 结果 各中间载体经PCR法，限制性酶切分析，DNA测序证实正确。转染的293细胞中2-3天产生病毒，7-10天出现病毒斑。最终的包装病毒中携带有目的基因hIFNβ。并能够在包装细胞中的表达。空斑形成实验法测定病毒滴度测得病毒滴度约为1.6×109pfu/ml，能够满足接下来的体外基因治疗试验。 结论 大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便的构建出含有目的基因的腺病毒载体Ad-hIFNβ，重组子能够在HEK293细胞中扩增，病毒包装的成功为进一步研究hIFNβ基因治疗肿瘤提供了一个良好的转导载体。

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文摘

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前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

腺病毒载体与基因治疗

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