大鼠脊髓损伤前后蛋白质组学变化及GFAP酪氨酸硝基化研究

摘要

研究背景 脊髓损伤可由多种病因引起，患者运动功能降低或完全丧失，导致生活质量低下。目前，对脊髓损伤的研究仍是神经科学领域急需攻克的难点之一。随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。蛋白组学及其相关学科的发展，已经表现出良好态势，在疾病诊断、个性化治疗、疫苗开发等方面都呈现出美好的前景。但是，应用蛋白质组学方法研究大鼠脊髓损伤前后蛋白质组学变化尚未见报道。 继发性脊髓损伤是引起脊髓受损的主要因素，而继发性脊髓损伤造成脊髓缺血缺氧引发的氧化炎症反应在脊髓损伤过程中起着重要作用。蛋白酪氨酸硝基化是一氧化氮介导的氧化炎症反应的指示剂。最近研究发现蛋白酪氨酸硝基化，做为一种蛋白转录后修饰，对蛋白的结构和功能改变起着重要的作用。目前有关细胞骨架蛋白发生酪氨酸硝基化的研究发现，肌动蛋白(Actin)酪氨酸硝基化后可发生多聚化，多聚化的肌动蛋白可引起细胞的变形、黏附能力的下降以及胞内运输障碍，最终会导致细胞调亡和器官功能丧失；而游离的硝基化酪氨酸整合至a-tubulin(微管蛋白)可显著地改变微管的结构，对细胞的分化有着重要的意义。GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)是星型胶质细胞特异性表达的细胞骨架蛋白，继发性脊髓损伤过程中GFAP是否发生酪氨酸硝基化还未见报道。研究大鼠脊髓损伤前后蛋白质组学变化和GFAP的酪氨酸硝基化，可以进一步分析脊髓损伤的病理分子机制，并可为临床针对脊髓损伤后运动功能恢复的不同时期，研制更为有效的减少脊髓继发性损伤的新型药物和制定更为合理的治疗方案提供科学依据。 目的 1．通过对大鼠脊髓损伤前后蛋白质表达变化的分析，以发现对脊髓损伤和修复有重要意义的蛋白质； 2．运用多种方法对GFAP是否发生酪氨酸硝基化进行证实和验证，进一步揭示脊髓损伤的发病机制。 方法 1．选择清洁级SD雄性大鼠70只，体质量220～250g,由第二军医大学实验动物中心提供。随机分成3组：正常对照组(n=8)，假手术组(n--25)，脊髓损伤组(n--37)。2d以内新生SD大鼠10只，雌雄不拘。 2．参照Allen脊髓损伤模型法致脊髓中度损伤建模。假手术组和脊髓损伤组按不同时相点分别于术后为1，3，7，14d处理，灌注固定、行损伤区脊髓取材、切片、酪氨酸硝基化抗体组织化学免疫荧光染色、或GFAP和Ntyr的免疫荧光双标，镜下观察。 3．在建模基础上，分别取假手术和脊髓损伤1d组大鼠，深度麻醉下行损伤区脊髓1cm取材，按步骤进行组织裂解、二维凝胶电泳、蛋白质谱分析；并在蛋白电泳凝胶考染后行50KD条带的蛋白质谱分析。 4．取假手术和脊髓损伤1d组大鼠，分别在深度麻醉下取损伤区脊髓1ClTI，按步骤行组织裂解、Westernblot印迹对免疫荧光染色的结果进行验证；并进行GFAP蛋白的IP(免疫共沉淀)，对所得蛋白行酪氨酸硝基化抗体的蛋白免疫印迹杂交；再行Ntyr(硝基化酪氨酸蛋白)的IP实验，并对所得蛋白行GFAP抗体的蛋白免疫印迹杂交以验证GFAP蛋白是否发生了酪氨酸硝基化。 5．体外原代培养星型胶质细胞，经硝化试剂处理，采用免疫荧光双标观察GFAP和Nty的共定位情况；并裂解细胞进行Westernblot印迹杂交，对在体实验的结果进一步验证。 结果 1．免疫荧光组织化学结果显示，正常和假手术大鼠脊髓中仅有少量胶质细胞酪氨酸蛋白硝基化呈阳性，未发现酪氨酸硝基化蛋白阳性神经元。脊髓损伤组中酪氨酸硝基化蛋白位于脊髓前角运动神经元、胶质细胞以及脊髓中央管的室管膜细胞中。脊髓损伤组酪氨酸硝基化蛋白阳性神经元数随着脊髓损伤后时程的延长和运动功能的恢复而逐渐减少。在脊髓损伤后1d时最高，脊髓损伤后7d时明显减少，14d后降至更低，但仍有少量表达。各时相点之间有显著差异(P<0．05)。 2．二维电泳考染胶经图像分析软件处理后共检测到假手术组和脊髓损伤1d组脊髓蛋白表达差异(>5倍)蛋白点8个，进行蛋白质谱分析检测，鉴定出5个蛋白，2个蛋白点未能检测出，1个蛋白点检测出两个蛋白。 3．Westernblot印迹杂交显示其中一个50KD的酪氨酸硝基化蛋白条带表达量较大，经SDS-Page电泳胶考染后取此蛋白条带行蛋白质谱分析，鉴定结果为GFAP。 4．脊髓损伤组织免疫组化和体外培养星型胶质细胞经硝化试剂处理后免疫组化显示GFAP和Ntyr有共定位现象。GFAP蛋白IP后进行Ntyr抗体印迹杂交的结果为阳性，Ntyr蛋白的IP后进行GFAP抗体印迹杂交的结果也为阳性，验证发现GFAP的确发生了酪氨酸硝基化。 5．裂解体外原代培养的星型胶质细胞的Westernblot杂交结果显示，未经硝基化试剂处理组酪氨酸硝基化蛋白有少量表达，硝基化试剂处理组酪氨酸硝基化蛋白呈现大量表达，两组有显著差异(P<0．01)。 结论： 1．正常组和假手术组大鼠脊髓仅有少量胶质细胞酪氨酸蛋白硝基化呈阳性反应，未发现酪氨酸蛋白硝基化阳性神经元。脊髓损伤组酪氨酸硝基化蛋白位于脊髓前角运动神经元、胶质细胞以及脊髓中央管的室管膜细胞中；且随着脊髓损伤后时程的延长，运动功能的恢复，脊髓内酪氨酸硝基化蛋白阳性神经元数逐渐减少。 2．大鼠脊髓损伤前后蛋白质谱分析鉴定发现5个损伤前后表达量差异超过5倍的蛋白：异柠檬酸脱氢酶(1080)，泛醌．细胞色素c还原酶(复合体III亚基II)(984)，胆绿素还原酶B(1410)，磷酸丙糖异构酶(1441)，不均一核糖核酸核糖核蛋白A2／B1异构体Bl蛋白(1226)。 3．Westernblot一维蛋白电泳基础上的蛋白质谱分析鉴定，免疫荧光GFAP和Ntyr(硝基化酪氨酸)共定位结果与双重IP验证，发现GFAP发生了酪氨酸硝基化，此项为国内外首次报道。 4．分析提出脊髓致伤后蛋白表达变化和GFAP酪氨酸硝基化可能与脊髓损伤和恢复关系密切，为进一步研究脊髓损伤的胶质疤痕形成机制和设计新的治疗药物开拓了新思路。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

前言

第一部分 大鼠脊髓损伤后运动功能恢复过程中酪氨酸硝基化蛋白表达的变化

第二部分 大鼠脊髓损伤前后的脊髓组织的蛋白质组学研究

第三部分 大鼠脊髓损伤前后GFAP蛋白酪氨酸硝基化的研究

结论

综述 硝基化酷氨酸研究进展

硕士在读期间参与编撰文章

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致谢