食管癌中食管癌相关基因ECRG-1表达下调机制的研究

摘要

食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的健康和生命。同大多数恶性肿瘤一样，食管癌的发生发展与多个癌基因和(或)抑癌基因的异常改变密切相关。在DNA和染色体水平，抑癌基因异常主要包括点突变、基因缺失、基因易位或重排以及甲基化模式改变，其中等位基因杂合性缺失(1ossofheterozygosity,LOH)和启动子的异常高甲基化是抑癌基因失活的主要机制，亦是恶性肿瘤普遍存在的分子事件。食管癌相关基因1(esophagealcancerrelatedgene1，ECRG-1)是应用差异显示技术克隆出的新的食管癌相关基因。以往研究表明，ECRG-1在正常食管上皮中表达，在95％的食管癌组织中低表达或阴性表达；同时体内外实验显示ECRG-1的过表达能够抑制肿瘤细胞生长，提示ECRG-1基因具有抑癌基因的特性。那么，ECRG-1在食管癌组织中表达下调的机制如何，目前尚不清楚，国内外亦未见相关报道。为研究食管癌形成过程中ECRG-1基因失活的主要机制，本研究采用聚合酶链反应-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染色(polymerasechainreaction-Simplesequencelengthpolymorphism，PCR-SSCP)、聚合酶链反应-限制性内切酶酶切-琼脂糖电泳(polymerasechainreaction-Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，PCR-RFLP)及亚硫酸氢盐处理模板-PCR扩增-测序技术，从杂合性缺失和异常高甲基化方面探讨ECRG-1在食管癌中失活的机制，为阐明食管癌发生发展机理和临床早期诊断及治疗提供理论依据。 目的研究食管癌组织中ECRG-1基因的杂合性缺失发生率及5’端侧翼序列目的片段CpG岛的甲基化状态，从分子水平探讨食管癌形成过程中基因失活的主要机制。 方法1.杂合性缺失分析：选取食管癌组织及邻近的正常组织80例，提取基因组DNA,以第二外显子189位的单核苷酸多态位点(singlenucleotidepolymorphism,SNP)和第八外显子869位限制性内切酶酶切位点为标志物，采用PCR-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染色及测序技术分析SNP位点的杂合性缺失发生率；采用PCR-限制性内切酶酶切-琼脂糖电泳技术分析酶切位点的杂合性缺失情况。 2.异常甲基化分析：首先培养食管癌细胞系EC9706、EC109、NEC，胃癌细胞系GLC，人胚胎肾永生化细胞系Hek293，猴肾成纤维细胞系COS7，鼠成纤维细胞系NIH3T3等细胞，提取细胞总RNA，应用RT-PCR技术检测细胞中ECRG-1的mRNA表达水平；分别提取ECRG-1阳性表达和阴性表达细胞株DNA及10对食管癌组织和邻近正常组织DNA，经亚硫酸氢盐处理DNA模板、PCR扩增目的片段后，应用PCR产物直接测序分析ECRG-1基因5’端侧翼序列CpG岛甲基化状态；三氧化二砷处理ECRG-1阴性表达细胞系，应用RT-PCR技术检测三氧化二砷诱导ECRG-1重新表达的情况。 3.统计学分析：采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理。率的比较应用x2检验，取a=0.05为显著性水准。 结果1.食管癌组织及邻近正常组织中ECRG-1基因在不同标记位点的LOH结果在80例食管癌组织中，PCR-SSCP法检测到信息个体25例，等位基因不平衡3例，SNP位点LOH6例(6/25)，非LOH个体19例；PCR-RFLP法显示信息个体28例，等位基因不平衡3例，酶切位点发生LOH的6例(6/28)，非LOH个体22例；两种方法均示信息个体18例，两个位点均发生LOH4例(22.2％)；至少一种方法显示为信息个体35例，至少一个位点发生LOH8例(23％)。在两个标记位点中，SNP位点LOH率较高(24％)，酶切位点LOH率较低(21.5％)，两者之间无显著性差异(P＞0.05)。 2.细胞株中ECRG-1的表达把ECRG-1基因cDNA全长转染食管癌细胞系EC109，以ECRG-1在细胞EC109中的表达为阳性对照，结果显示ECRG-1在食管癌细胞系EC9706、NEC和EC109、胃癌细胞系GLC及人胚胎肾永生化细胞系Hek293中、鼠成纤维细胞系NIH3T3中均阴性表达，而在猴肾成纤维细胞株COS7中有一定程度表达。 3.5’端侧翼序列CpG岛的甲基化状态在阴性表达ECRG-1的食管癌细胞系EC9706、NEC和EC109中，目的片段CpG位点的核苷酸C仍是C，未发现一个转换成T，提示均呈高甲基化；而在ECRG-1表达的COS7细胞亦未检测到一个非甲基化的位点；测序结果显示，癌组织和邻近正常组织目的片段序列相同，所测CpG位点均呈高甲基化状态，CpG位点甲基化状态在两种组织间无差异。 4.三氧化二砷诱导去甲基化分别应用浓度为1μmol/L和2.5μmol/L的三氧化二砷对不表达ECRG-1的细胞株EC9706、NEC和EC109进行去甲基化诱导7d和3d，RT-PCR结果均未检测到ECRG-1的重新表达。 结论1.ECRG-1基因在食管癌组织中存在一定程度的杂合性缺失(LOH)，此分子异常可能在食管癌的发生发展中起一定的作用，可能是导致Ecrg-1蛋白表达水平降低的机制之一，但由于LOH率小于50％，提示LOH不是ECRG-1失活的主要机制。 2.限制性内切酶酶切位点和SNP位点可以作为标记物用于检测ECRG-1基因的LOH。PCR-RFLP技术和PCR-SSCP-测序技术各有优缺点，但均为检测ECRG-1等位基因LOH的可靠方法。 3.ECRG-1基因5’端侧翼序列目的片段CpG岛的高甲基化与食管癌的发生无关，与ECRG-1表达下调无关。 4.本研究为继续探讨ECRG-1基因在食管癌中表达下调的机制奠定了前期试验基础。

目录

文摘

英文文摘

郑重声明

引言

实验材料与方法

结 果

讨 论

小 结

附 图

参考文献

综述甲基化与食管癌的研究进展

英文缩写

致 谢