钙镁离子环境改变对人恶性胶质瘤原代细胞侵袭力影响的体外研究

摘要

背景和目的：胶质细胞瘤是最常见的中枢神经系统原发性肿瘤,占原发性中枢神经系统肿瘤的40％。胶质瘤易复发、预后差,其主要原因是胶质瘤侵袭性生长的生物学特性使各种治疗措施难以达到治愈目的。而钙离子在肿瘤细胞侵袭、转移中是一个关键的离子信号;镁离子作为天然的钙离子拮抗剂,其对肿瘤细胞浸润的影响也值得关注。肿瘤的浸润和转移是由肿瘤细胞和基质成分共同参与完成的,其中的基本步骤是对ECM和血管基底膜的降解和破坏。实验证明,瘤细胞浸润转移的能力与其诱导产生蛋白酶降解细胞外基质(Extra Cell Matrix,ECM)、基底膜的能力密切相关。在肿瘤组织中,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)通过调节肿瘤细胞与ECM的黏附,降解肿瘤细胞外基质成分,增加肿瘤新生血管形成来参与肿瘤的侵袭生长和转移。肿瘤细胞体外培养液加入钙镁离子可以改变肿瘤细胞分泌MMPs的能力,从而对肿瘤细胞的侵袭力有所影响。原代培养也叫初代培养,是从供体取得离体细胞后在体外进行的首次培养。原代培养的细胞因组织和细胞刚刚离体,生物学性状未发生明显变化,最接近和反映体内的生长特性。目前,已有部分人类的胶质瘤细胞被成功培养,其中以星形细胞瘤报道居多,而室管膜瘤细胞尤其是人类室管膜瘤细胞的原代培养国内却未有报道。传统的胶质瘤细胞分离法为酶消化法和机械分散法,本实验首次采用“机械分散法+胰酶消化法”的综合分离方法培养星形细胞瘤细胞和室管膜瘤细胞,并将三种分离方法各自的特点加以对比,以期找出更为廉价,有效的原代细胞的培养方法。本实验在原代细胞培养的基础上通过体外调节钙,镁离子浓度的变化探讨离子环境的改变对人恶性胶质瘤细胞的侵袭能力的影响,从而进一步探讨胶质瘤侵袭性生长的分子机制。
　　材料和方法：1.取新鲜手术标本并做常规病理检查本实验取胶质细胞瘤手术后的新鲜离体标本,一部分送常规病理检查,剩余大小约1cm×1cm×1cm的组织无菌包裹,送入无菌培养间培养。对用常规病理检查(HE及免疫组化)证实为星形细胞瘤和室管膜瘤的标本继续培养。2.胶质瘤标本的处理应用机械分散法+胰酶消化法分离细胞。200目滤网过滤后的细胞悬液按800~1000 r/min离心5min后去上清,培养液重悬后调整细胞浓度并接种。3.胶质瘤的原代培养用上述分离方法得到的细胞,细胞悬液计数1×106/ml后,在DMEM培养基(加10％胎牛血清)、37℃、5％CO2条件下、培养板中培养,每隔3~4d换培养液1次;细胞长满底部70％~80％后,用0.25％胰蛋白酶消化,细胞计数,传代。继续培养,对细胞进行形态学观察、免疫细胞化学鉴定,取生长良好的第三代细胞弃去其带有FBS的DMEM培养液,加入新鲜的不含FBS的DMEM培养液,并在其内添加钙镁离子,调节钙离子浓度分别为0.8mmol/L,1.2mmol/L,1.6 mmol/L,2.0 mmol/L,调节镁离子浓度分别为0.5 mmol/L,1.0 mmol/L,1.5mmol/L,2.0 mmol/L,不含钙镁离子的作为空白对照组。将这些细胞培养24时后取其细胞和上层悬液分别做Boyden chamber侵袭小室实验和聚丙烯酰胺明胶酶谱电泳。4.细胞形态学观察用倒置相差显微镜观察活细胞的形态学和生长状态的变化,观察不同级别的星形细胞瘤和室管膜瘤的形态学和生长状态。5.免疫细胞化学鉴定采用SP法,对星形细胞瘤检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、Ⅳ型胶原(CollagenⅣ)和巢蛋白(nestin)的表达。对室管膜瘤细胞检测GFAP、CD99和EMA的表达。6.Boyden chamber实验Boyden chamber小室测定原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞及Ⅱ级、Ⅲ级室管膜瘤细胞,在相同的培养时间和不同的培养条件下,观察钙镁离子影响下的不同级别的胶质瘤细胞侵袭力的差别。7.明胶酶谱法检测MMP-2酶和酶原的表达情况。明胶酶谱法检测不同浓度钙镁离子影响下的不同级别的胶质瘤细胞MMP-2酶和酶原的表达情况的差别,从而判断体外钙镁离子浓度的不同对胶质瘤细胞侵袭力影响的差别。8.统计学处理以上结果用SPSS10.0软件进行统计处理,数据结果采用(?)±S表示,方差分析,以a=0.05为显著性水平。
　　结果：1.常规病理检查诊断为星形细胞瘤的手术标本20例,共培养成活16例,其中Ⅲ级(间变性星形细胞瘤)7例,Ⅳ级(胶质母细胞瘤)9例;室管膜细胞瘤的手术标本11例,成活9例,其中室管膜瘤(Ⅱ级)7例,间变性室管膜瘤(Ⅲ级)2例。2.原代培养:应用物理和化学方法,成功地培养出星形细胞瘤和室管膜瘤原代细胞。肿瘤级别不同,细胞的生长活性不同,其中Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤可以成活并可稳定传代4-6代(约28d),Ⅱ,Ⅲ级室管膜瘤可以成活且能传4-5代(约25d)。3.形态学观察:倒置显微镜下,发现细胞形态多样,大小不一;其中星形细胞瘤细胞呈星形、三角形、菱形或梭形。肿瘤级别越高,细胞贴壁时间越短,生长越旺盛,并呈交错性生长(细胞失去极性);室管膜瘤细胞呈玫瑰花结状排列,大小不一,胞质丰富,无分枝状突起。4.免疫细胞化学检查:原代培养的星形细胞瘤GFAP呈阳性、Ⅳ型胶原CollagenⅣ呈阴性,nestin阳性(Ⅳ级星形细胞瘤);原代培养的室管膜细胞瘤GFAP呈阳性、CD99阳性,EMA阴性。为此,结合细胞的形态、生长方式及免疫细胞化学结果,证实所培养的细胞分别为星形细胞瘤细胞和室管膜细胞瘤细胞。5.Boyden小室体外侵袭实验结果:原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞,Ⅱ,Ⅲ级室管膜瘤细胞随着体外钙离子浓度的升高,其穿膜细胞数先增高后降低,随着镁离子浓度的升高,其穿膜细胞数呈降低趋势。在侵袭实验中,在相同的培养时间和培养条件下,与Ⅲ级星形细胞瘤细胞相比,Ⅳ级星形细胞瘤细胞不同时间的穿膜细胞数均高于Ⅲ级星形细胞瘤细胞,其差异有统计学意义(P<0.05)。与Ⅱ级室管膜瘤细胞相比,Ⅲ级室管膜瘤细胞不同时间的穿膜细胞数均高于Ⅱ级室管膜瘤细胞,其差异有统计学意义(P<0.05)。6.明胶酶谱的凝胶电泳结果:原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞,Ⅱ,Ⅲ级室管膜瘤细胞随着体外钙镁离子离子浓度的不同,出现4到5条透明条带,分子量为62kD,64kD,72kD,82kD和92kD,分别是MMP-2、MMP-2中介体、proMMP-2、MMP-9和proMMP-9。随钙离子浓度的升高,MMP-2的含量先增高后降低,随着镁离子浓度的升高,MMP-2的含量呈降低趋势。钙离子的组别之间的差异无统计学意义(P>0.05),镁离子的组别之间的差异有统计学意义(P<0.05)
　　结论：1.采用“机械分散法+胰酶消化法”的综合分离法可较好的进行星形细胞瘤和室管膜瘤组织的原代细胞培养,是经济、有效的胶质瘤原代培养的方法。2、原代培养的星形细胞瘤细胞的形态区别于室管膜瘤细胞,前者细胞多呈星形,三角形不等,后者则呈玫瑰花结状。3.体外钙镁离子环境改变可以影响恶性胶质瘤原代细胞的侵袭力:随着体外钙离子浓度的升高,原代培养的Ⅲ级、Ⅳ级星形细胞瘤细胞,Ⅱ,Ⅲ级室管膜瘤细胞的侵袭力先增高后降低,随着镁离子浓度的升高,其侵袭力呈现降低趋势。

目录

摘要

Abstract

论文部分 钙镁离子环境改变对人恶性胶质瘤原代细胞侵袭力影响的体外研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述部分 钙镁离子对恶性肿瘤的侵袭和转移影响的研究进展

参考文献

在读硕士期间发表的文章

英文缩写词索引

致谢