白藜芦醇对胃癌BGC-823细胞中凋亡相关基因PDCD5表达影响的研究

摘要

背景和目的:胃癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一,目前胃癌已成为中国内地第三大常见肿瘤,严重威胁人民的健康和生命,是我国重点研究的恶性肿瘤之一。人程序化死亡分子5(the human programmed cell death5,PDCD5)基因是由北京大学人类疾病基因研究中心1999年在国际上首先报道的一个人类新基因,是从人白血病细胞株TF-1细胞中克隆到的凋亡相关新基因(GeneBank登记号AF014955)。PDCD5定位于19q12-q13.1,参与细胞凋亡过程的调控。PDCD5的mRNA在50余种人类组织中均有表达,并不限定于造血系统,其中在成年心、睾丸、肾、肾上腺及胎盘中高表达,其中胚胎组织表达明显低于成年组织,国内外已有多家实验室利用不同技术发现PDCD5在疾病情况下,特别是在肿瘤、自身免疫性疾病和局部损伤的情况下表达明显下降。白藜芦醇(resveratrol,Res)是广泛存在于葡萄、虎杖、花生等药用植物中的一种多酚类化合物,作为低毒的天然药物,对消化、呼吸、血液、生殖等多个系统来源的肿瘤细胞有抑制作用,可显著抑制多种人类肿瘤细胞的生长、诱导肿瘤细胞凋亡。研究表明它可以通过抗氧化、抑制环氧化酶(COX)、抑制细胞色素P450酶、诱导肿瘤细胞分化和促进肿瘤细胞凋亡等来发挥抗癌作用。
　　为探讨白藜芦醇对人胃低分化腺癌BGC-823细胞中PDCD5蛋白和mRNA表达的影响以及白藜芦醇对BGC-823细胞生长的抑制作用,本研究采用免疫细胞化学SP法检测PDCD5在BGC-823细胞中的蛋白表达;采用原位杂交技术检测BGC-823细胞中PDCD5在mRNA水平上的表达;采用流式细胞术和TUNEL法检测BGC-823细胞的增殖与凋亡。探讨PDCD5在BGC-823细胞中的表达与BGC-823细胞凋亡的相关性,为胃癌的临床治疗提供理论依据。
　　材料和方法:1.标本:人胃低分化腺癌细胞BGC-823购自中科院上海细胞生物学研究所,经复苏孵育,传代分为不同的实验组,分别用25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的白藜芦醇处理BGC-823细胞24h、48h、72h。并设空白对照组(培养液对照组),溶剂对照组(DMSO对照组),顺铂组(3μg/ml),联合用药组(白藜芦醇200μmol/L+顺铂3μg/ml)。2.应用免疫细胞化学SP法检测各组BGC-823细胞中PDCD5蛋白表达。3.应用原位杂交技术检测各组BGC-823细胞中PDCD5 mRNA表达。4.应用流式细胞技术检测各组分别作用24h、48h、72h细胞的增殖分化情况。5.应用流式细胞技术检测各组分别作用24h、48h、72h细胞的凋亡情况。6.应用TUNEL法检测各组作用24h细胞凋亡的情况。7.采用SPSS11.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差(±S)表示,两组均数的比较用t检验(t-test);两组以上均数的比较用方差分析(ANVOA);以α=0.05为显著性检验标准。
　　结果:1.免疫细胞化学结果:PDCD5蛋白在人胃低分化腺癌BGC-823细胞中低表达;以25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4种不同浓度的白藜芦醇作用于BGC-823细胞24h、48h、72h后PDCD5蛋白表达均较空白对照组有所升高;3个时间段内随着浓度增加,PDCD5蛋白表达增高,且呈浓度依赖性,50-200μmol/L白藜芦醇组与空白对照组及溶剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),各实验组之间两两相比,差异有统计学意义(P<0.05);4个实验组中随着时间延长,PDCD5蛋白表达升高,差异无统计学意义(P>0.05);25μmol几白藜芦醇组、溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3个时间段内实验组及顺铂组与联合组相比,差异有统计学意义(P<0.05),联合组中PDCD5蛋白的表达随着作用时间的延长而升高,以作用72h升高最显著,三个时间段相比,差异有统计学意义(P<0.05)。2.原位杂交结果:PDCD5 mRNA在人胃低分化腺癌BGC-823细胞中低表达;以25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L4种不同浓度的白藜芦醇作用于BGC-823细胞24h、48h、72h后PDCD5 mRNA表达均较空白对照组有所升高;3个时间段内随着浓度增加,PDCD5 mRNA表达增高,白藜芦醇浓度在50μmol/L以上实验组与空白对照组及溶剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),各实验组之间两两相比,差异有统计学意义(P<0.05);4个实验组中随着时间延长,PDCD5mRNA表达升高,差异无统计学意义(P>0.05);25μmol/L白藜芦醇组、溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3个时间段内实验组及顺铂组与联合组相比,差异有统计学意义(P<0.05),联合组中PDCD5 mRNA的表达随着作用时间的延长而升高,以作用72h升高最显著,三个时间段相比,差异有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞技术检测细胞增殖分化结果:BGC-823细胞在经25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的白藜芦醇处理24h、48h、72h后,G1期及G2期比例均较空白对照组有所下降,S期比例较空白对照组有所升高;3个时间段内随着浓度的升高,G1期、G2期比例逐渐下降,S期比例逐渐升高,50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L白藜芦醇组与空白对照组及溶剂对照组相比,G1期、G2期比例的下降和S期比例的升高有统计学意义(P<0.05),各实验组之间两两相比,S期比例的升高有统计学意义(P<0.05);同一浓度的白藜芦醇作用后随着时间的延长G1期、G2期比例逐渐下降,S期比例逐渐升高,但无统计学意义(P>0.05);25μmol/L白藜芦醇组、溶剂对照组与空白组相比周期差异无统计学意义(P>0.05)。3个时间段内实验组及顺铂组与联合组相比,周期比例差异有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞技术检测细胞凋亡结果:空白组BGC-823细胞流式细胞仪检测是活细胞;在同一时间段的各个样品中,随着白藜芦醇浓度的增加,细胞早期凋亡率和晚期凋亡及坏死率逐渐升高,且早期凋亡率升高显著,白藜芦醇浓度在50μmol/L以上的实验组与空白对照组及溶剂对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),各实验组之间两两相比,细胞早期凋亡率差异有统计学意义(P<0.05):同一浓度的白藜芦醇作用后随着时间的延长细胞早期凋亡率和晚期凋亡及坏死率逐渐升高,但差异无统计学意义(P>0.05);25μmol/L白藜芦醇组、溶剂对照组与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05)。3个时间段内实验组及顺铂组与联合组相比,细胞早期凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),晚期凋亡及坏死率差异不显著(P>0.05)。5.TUNEL结果:用TUNEL方法检测到的凋亡细胞的细胞核呈棕褐色,染色质分布不均,染色深浅不一。空白对照组中几乎未见到凋亡细胞,而实验组中的凋亡细胞数随白藜芦醇浓度的增加明显增加,白藜芦醇浓度50μmol/L以上实验组,顺铂组及联合用药组与空白对照组及溶剂对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);各实验组之间两两相比,差异有统计学意义(P<0.05);200μmol/L白藜芦醇组与顺铂组相比,差异无统计学意义(P>0.05),其他白藜芦醇组与顺铂组相比,差异有统计学意义(P<0.05);实验组及顺铂组与联合组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　结论:1.白藜芦醇能以剂量依赖的方式上调BGC-823细胞中PDCD5的蛋白及mRNA表达并使BGC-823细胞阻滞在S期、诱导细胞凋亡。2.白藜芦醇诱导后BGC-823细胞出现细胞凋亡等一系列形态学改变及BGC-823细胞中PDCD5蛋白及mRNA表达上调,表明PDCD5参与了胃癌细胞的凋亡,白藜芦醇可以通过上调PDCD5的表达而诱导胃癌细胞凋亡。3.白藜芦醇能增强顺铂的诱导凋亡作用。

目录

摘要

Abstract

论文部分 题目:白藜芦醇对胃癌BGC-823细胞中凋亡相关基因PDCD5表达影响的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 凋亡相关基因PDCD5及其与肿瘤关系的研究进展

参考文献

中英文缩写词

致谢