以HIV-1复制和CXCR4、CCR5启动子为靶点的抗HIV/AIDS药物筛选系统的建立及应用

摘要

背景与目的：获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immure Deficiency Syndrome,AIDS)即艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染,攻击人类免疫系统,破坏大体CD4+T淋巴细胞而引起的一种严重免疫缺陷性疾病。艾滋病在全球蔓延的速度令人震惊,我国HIV／AIDS感染者也在迅猛增加。尽管联合高效抗逆转录病毒疗法(hightly active antiretroviral therapy,HAART)在治疗艾滋病上已经取得了明显进展,但是,由于其治疗费用昂贵而无法广泛地应用到发展中国家,并且毒副作用和多种耐药株报道已屡见不鲜。为此,开发和使用低毒、高效、可长期使用的中草药或者其他廉价药物治疗艾滋病已经刻不容缓。
　　 中药是我国特有的药物资源,在传统中医药的理论研究与应用方面有着坚实的基础。中医药治疗艾滋病具有药源丰富、价格低廉、毒副作用小,作用持久等特点,在抗AIDS的研究得到普遍重视。因此,在极其丰富的中药资源宝库库中,如何筛选出抗HIV／AIDS病毒药物,仍然是急需解决的急迫问题。
　　 分析HIV基因结构:HIV基因组由两个拷贝的正链单股RNA组成,全长约9.7kb,含有gag、pol、env三个结构基因,以及tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调控基因。在基因组的5’端和3’端各含长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR),其中LTR5’端中含有HIV基因调控所必需的多个特定调控区,是一组真核增强子和启动子(Promoter)序列。启动子对HIV病毒的复制起着关键作用,如果能够抑制启动子的活性就可以阻止HIV病毒复制。
　　 本课题应用了一种以HIV-1复制为靶标,可以在细胞水平应用于常规实验室的安全药物筛选载体(pNL4-3 Luc R-E-)。该载体的特点是:含有HIV-1的核心基因,敲除了HIV-1基因组中env、vpr和nef基因,可在常规实验室操作。并且,该载体在nef基因的位置引入报告基因(荧光素酶基因),通过测定报告基因的表达可以反映HIV-1的复制水平,因此,可以此作为评价药物效果的重要指标。
　　 从HIV病毒攻击靶细胞的机制分析:CD4分子是HIV进入靶细胞的主要受体,但是仅有CD4尚不足以使HIV病毒侵入细胞,还必须有辅助受体与CD4分子的协同作用,HIV才能进入宿主细胞。CXCR4(CXC-chemokine receptor4)和CCR5(CC-chemokine receptor5)是HIV感染宿主细胞主要辅助受体,它们主要分布在机体免疫细胞表面,属于趋化因子家族,是G蛋白偶联的膜受体。CXCR4启动T细胞嗜性(T-tropic)的HIV-1病毒株感染宿主细胞,CCR5则允许M嗜性(M-tropic)的HIV-1病毒株感染宿主细胞。由于在HIV病毒感染的无症状期和血清抗体刚刚转阳所分离出的病毒株主要是M-tropic毒株,利用CCR5在病毒传播过程中起作用,所以,CCR5主要在病毒感染的早期阶段起重要作用。CXCR4则通过T细胞嗜性病毒株在艾滋病感染的晚期起作用。在HIV病毒感染宿主细胞过程中,先是病毒表面的糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4结合,使其吸附在宿主细胞上,gp120再与宿主细胞表面辅助受体CXCR4／CCR5相互作用,使病毒进一步接近宿主细胞,随后病毒表面的跨膜蛋白gp41发生构象变化,插入靶细胞膜中,导致病毒包膜与宿主细胞膜的融合,HIV病毒RNA进入细胞。因此,以辅助受体为靶点进行抗HIV研究是近年来研究的热点。
　　 中药是我国独特而丰富的药物资源宝库,其中是否存在能够抑制HIV病毒复制或者影响辅助受体CXCR4和CCR5启动子的活性、降低其表达的药物,值得进一步研究。采用中药血清药理学方法(Chinese medicine serumpharmacology,CMSP),将单味中药或复方经口给动物灌服一定时间后,采集动物血液,分离血清,用此含药血清刺激细胞,不但能够直接反映中药和其代谢产物的药理作用,而且此过程更接近药物在体内环境的真实过程,可用于观察药物药效和阐明中药的作用机制。
　　 本课题将假病毒技术、报告基因技术和中药血清药理学技术相结合。运用假病毒技术和报告基因技术,拟建立作用于HIV及其辅助受体CXCR4和CCR5启动子的安全药物筛选模型；优化实验检测条件,建立安全药物筛选体系；通过检测报告基因萤光素酶活性,观察药物对HIV及其辅助受体的影响；筛选出1-2种具有抗病毒作用的中药,健康志愿者口服中药,检测药物对人外周血T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5的表达的影响；体外病毒实验,分析所筛选出的中药,是否对HIV病毒的侵入和复制有抑制作用,验证药物的抗病毒效果,建立安全稳定的抗HIV／AIDS药物筛选系统。
　　 方法：
　　 1.设计并合成扩增CXCR4和CCR5启动子的引物,提取人基因组DNA；
　　 2.以人基因组DNA为模板,PCR扩增CXCR4和CCR5的启动子基因序列,将其克隆入T载体后,转化DH5a,进行蓝白筛选；
　　 3.PCR鉴定阳性重组子pGEM—T—CXCR4和pGEM—T—CCRS；
　　 4.再将CXCR4和CCR5启动子分别亚克隆入萤光素酶报告载体pGL4.17中；
　　 5.PCR、双酶切筛选阳性重组子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5,并进行DNA序列测定；
　　 6.脂质体包裹分别转染阳性重组子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5以及阳性对照质粒:pGL4.13(含有SV40启动子)和阴性对照质粒:pGL4.17(不含启动子)入人淋巴细胞H9细胞(HT—H9)中,G418筛选稳定转染细胞株；
　　 7.将稳定转染的细胞进行实验分组。实验组1:转染阳性重组子pGL4.17-CXCR4；实验组2:转染阳性重组子pGL4.17-CCR5;阳性对照组:转染pGL4.13质粒；阴性对照组:转染pGL4.17质粒:
　　 8.荧光检测仪OloMaxTM96孔板发光检测仪检测稳定转染细胞株萤光素酶活性,验证阳性重组子中CXCR4和CCR5启动子活性。
　　 9.采用瞬时转染法,将含有HIV-1核心基因的载体pNL4-3 Luc R-E-和phRLSV40载体共转染入人胚肾293T细胞(HEK293T细胞)；
　　 10.优化实验条件:将稳定转染细胞株和瞬时转染细胞株分别进行实验优化,确定各自的优化条件。
　　 结果：
　　 1.PCR扩增获得CXCR4和CCR5启动子基因片段,电泳可见,在777bp和987bp处有明亮条带,这与设计的CXCR4和CCR5启动子序列长度一致。
　　 2.以T7／SP6为引物,PCR筛选分别得到约为953bp(CXCR4)和1163bp(CCR5)的阳性克隆扩增片段,即为阳性重组子pGEM-T-CXCR4和pGEM—T-CCR5。
　　 3.分别以CXCR4序列引物和CCR5序列引物PCR扩增,电泳可见,在接近750bp处有一明亮条带,与CXCR4启动予序列的理论值777bp一致；在接近1000bp处也有一明亮条带,与CCR5启动子序列的理论值987bp一致。
　　 4.分别用KpnⅠ／NheⅠ和XhoⅠ／HindⅢ双酶切鉴定重组载体pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5,电泳可见:在777bp和987bp有明亮条带与理论值一致。
　　 5.DNA序列测序,阳性重组子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5中CXCR4和CCR5启动子基因片段与设计的CXCR4和CCR5启动子序列完全一致。
　　 6.将阳性重组子pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5以及阳性对照质粒pGL4.13和阴性对照质粒pGL4.17转染入HT-H9细胞,测定实验组1、实验组2、阳性对照组和阴性对照组的细胞萤光素酶活性,结果显示:实验组1细胞萤光值为1127300±96331.5,实验组2细胞萤光值为1158600±61674.4,阳性对照组细胞萤光值为850045±24520.6,阴性对照组细胞萤光值为349281±19349.4。实验组1和实验组2的细胞萤光素酶活性较阴性对照组和阳性组均明显升高(P<0.01)。
　　 7.实验优化结果显示:稳定转染组,细胞接种量每孔104个,为最佳实验条件；瞬时转染组,细胞接种量为105个每孔,为最佳实验条件。
　　 方法：
　　 1.选取具有抗病毒作用的16种中药:丹参、鱼腥草、甘草、穿心莲、夏枯草、黄柏、五倍子、青蒿、大黄、天花粉、紫花地丁、桑白皮、牛蒡子、黄芩、苦参、杜仲(质量符合中国药典)。采用煎煮的方法将其制成煎剂,分别给成年Wistar大鼠连续灌胃七天,采血并分离含药血清；
　　 2.将细胞进行分组:将转染阳性重组载体pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5的H9细胞分别设19组,同时将转染含有HIV-1核心基因的载体pNL4-3 Luc R-E-的HEK293T细胞设为19组。16种含药血清处理的HT—H9细胞和293细胞设为实验组:正常鼠血清处理的HT-H9细胞和HEK293T细胞设为对照组；只转染pGL4.17-CXCR4、pGL4.17-CCR5质粒(或pNL4—3 LucR-E-载体),不给与任何干预处理的设为空白组；不含有转染子的HT-H9细胞和HEK293T细胞为非转染组。
　　 3.16种含药血清分别作用于各组转染细胞,检测经含药血清刺激后细胞报告基因萤光素酶活性,判断药物对转染细胞的影响；
　　 4.ELISA检测经含药血清刺激后,转染pNL4-3 Luc R-E-载体的HEK293T细胞P24抗原含量,判断药物对HIV-1复制的抑制作用；
　　 结果：
　　 1.含药血清作用于转染重组载体pGL4.17-CXCR4的细胞后,细胞萤光素酶活性检测结果:与对照组(638581.0±16699.5)相比,鱼腥草(442365.3±24221.3)、穿心莲(382135.0±23108.51)、夏枯草(109843.7±5897.2)和黄柏(387082.0±32099.8)能够显著降低转染pGL4.17-CXCR4质粒的细胞萤光素活性(P<0.05)。而甘草(733387.7±41340.7)、五倍子(745135.6±60036.9)、杜仲(747833.1±37638.0)、天花粉(735567.5±38837.2)、紫花地丁(953172.5±46387.2)、桑白皮(704999.1±38774.9)则能显著升高转染细胞的萤光素酶活性(P<0.05)。丹参、青蒿、大黄、苦参、牛蒡子、黄芩这六种中药的含药血清与对照组相比,其对细胞萤光素酶活性的影响没有显著性差异(P>0.05)。
　　 2.含药血清作用于转染重组载体pGL4.17-CCR5的细胞后,细胞萤光素酶活性检测结果:与对照组(555470.9±42689.8)相比,穿心莲(356235.3±16377.8)、夏枯草(312649.9±24824.6)、丹参(424948.5±39411.6)和黄芩(346028.9±7363.6)能够显著降低转染pGL4.17-CCR5质粒的细胞萤光素活性(P<0.05),而青蒿(772168.6±63740.8)、大黄(757875.7±48654.4)、苦参(709069.3±29764.2)、牛蒡子(731764.3±37356.1)、杜仲(671401.6±63175.5)、桑白皮(770887.6±50600.4)则能够显著升高转染细胞萤光素酶活性(P<0.05)。鱼腥草、甘草、黄柏、五倍子、天花粉、紫花地丁这六种中药的含药血清与对照组相比,其对细胞萤光素酶活性的影响没有显著性差异(P>0.05)。
　　 3.转染pNL4-3 Luc R-E-载体的HEK293T细胞萤光素酶活性结果:与对照组(1.3575±0.10558)相比,鱼腥草(0.5165±0.04826)、穿心莲(0.5231±0.07381)、夏枯草(0.4140±0.07933)、紫花地丁(0.5182±0.06776)含药血清能够显著降低转染pNL4-3 Luc R-E-载体的HEK293T细胞萤光素酶活性(P<0.05)。而丹参、甘草、青蒿、五倍子、牛蒡子、天花粉、桑白皮、大黄、黄柏、黄芩、杜仲、苦参这12种中药的含药血清与对照组相比,其对细胞萤光素酶活性的影响没有显著性差异(P>0.05)。
　　 4.ELISA检测转染pNL4-3 Luc R-E-载体的HEK293T细胞HIV-1 P24抗原含量,结果显示:与对照组(2.2673±0.15924)相比,鱼腥草(0.734±0.05862)、穿心莲(1.3056±0.10085)、大黄(1.0963±0.09335)、黄芩(1.1887±0.06088)、黄柏(1.4490±0.114)、紫花地丁(1.3030±0.03318)含药血清能够显著降低细胞裂解液上清中P24蛋白含量(P<0.05),其抑制率依次为,鱼腥草:64.66％,穿心莲:42.42％,大黄:51.65％,黄芩:47.57％,黄柏:30.24％,紫花地丁:42.53％。
　　 5.其中,穿心莲和夏枯草的含药血清能够同时降低转染pGL4.17-CXCR4和pGL4.17-CCR5、pNL4-3 Lue R-E-载体的细胞萤光素酶活性(P<0.05)。并且,穿心莲还可以降低转染pNL4-3 Lue R-E-载体的HEK293T细胞的P24含量。
　　 方法：
　　 1.20名健康志愿者分为两组,每10人一组,分别口服穿心莲和夏枯草两种中药。每天用量为:穿心莲9g／d,夏枯草15g／d。每种中药连续口服7天,200ml／天,服药前后,分别采集人外周静脉血,收集外周血单个核细胞(PeripheralBlood Mononuclear Cell,PBMC)；
　　 2.免疫磁珠分离并回收CD3+T淋巴细胞,流式细胞术检测其回收效率；
　　 3.流式细胞术检测健康志愿者服药前后外周血T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5表达情况；
　　 4.采用实时荧光定量PCR的相对定量法,检测服药前后人外周血T淋巴细胞CXCR4和CCR5 mRNA表达水平；
　　 5.Western blot检测检测服药前后人外周血T淋巴细胞CXCR4和CCR5蛋白表达水平；
　　 6.体外病毒抑制实验,检测药物对HIV-1病毒复制的抑制作用。
　　 结果：
　　 1.流式细胞术检测免疫磁珠分离效果,结果显示:CD3+T淋巴细胞回收率≧95％:
　　 2.健康志愿者口服穿心莲,比较服药前后人外周血T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5表达情况:服药前T淋巴细胞表面CXCR4.表达量为35.61±2.634％,服药后T淋巴细胞表面CXCR4表达量为10.28±0.759％,较服药前降低了约71％；健康志愿者服药前T淋巴细胞表面CCR5表达量为26.66±2.568％,服药后CCR5表达量降低到10.57±0.973％,与服药前相比降低了约60％。
　　 3.健康志愿者口服穿心莲,比较服药前后人外周血T淋巴细胞表面CXCR4和CCR5表达情况:服药前T淋巴细胞表面CXCR4表达量为34.95±2.046％,服药后降低到9.97±0.864％,较服药前降低了71％；服药前T淋巴细胞表面CCR5表达量为25.08±1.928％,服药后降低到10.26±1.023％,较服药前降低了约60％。
　　 4.健康志愿者服药前后外周血T淋巴细胞表面CXCR4 mRNA表达结果显示:夏枯草组服药后CXCR4 mRNA表达较服药前降低了3倍(P<0.05),穿心莲组服药后CXCR4 mRNA表达较服药前降低了4倍(P<0.05)；
　　 5.健康志愿者服药前后外周血T淋巴细胞表面CCR5 mRNA表达结果显示:夏枯草组服药后CCR5 mRNA表达较服药前降低了3倍(P<0.05),穿心莲组服药后CCR5 mRNA表达较服药前降低了4倍(P<0.05)。
　　 6.Westen blot结果也显示:在相对分子量40kD位置处可见CXCR4蛋白表达,在相对分子量46kD位置处可见CCR5蛋白表达,且服药后CXCR4和CCR5蛋白表达量明显低于服药前(P<0.05)。
　　 结论：
　　 1.成功建立了以HIV-1复制和CXCR4、CCR5启动子为靶点的抗HIV／AIDS药物筛选系统；
　　 2.优化实验检测条件,确定了药物筛选时稳定转染细胞株和瞬时转染细胞株的最佳实验条件；
　　 3.穿心莲和夏枯草的含药血清能够同时降低转染pGL4.17-CXCR4、pGL4.17-CCR5以及pNL4-3 Luc R-E-载体的细胞萤光素酶活性；
　　 4.鱼腥草、穿心莲、夏枯草、紫花地丁含药血清能够显著降低转染含有HIV-1核心基因的载体pNL4-3 LucR-E-的HEK293T细胞萤光素酶活性；
　　 5.穿心莲和夏枯草能够抑制HIV-1病毒复制,具有潜在抗HIV／AIDS作用。