小分子干扰RNA抑制胃癌BGC823细胞EphA4基因表达的研究

摘要

目的：和背景
　　 胃癌是世界上第四大常见癌症并且是第二大导致死亡的癌症,它是严重危害我国健康人群的恶性肿瘤之一。年平均死亡率为25.53/10万。胃癌发病早期切除率比较高,但对于晚期病人切除、放疗、化疗均不理想。随着基因技术的发展,基因治疗成为近年癌症治疗的热点。
　　 促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin-producing hepatocytereceptor,Eph受体)激酶是受体络氨酸激酶家族中最大的家组,根据Eph受体家族的同源性、表达、分布及与配体的结合特性的不同,Ephrins受体可分为A与B两类。EphrinA4受体(简称EpbA4)属于A亚类,广泛参与细胞生长增殖与肿瘤的形成。
　　 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由dsRNA通过触发特定的互补的双链mRNA序列降解而抑制靶基因的表达。它通过21-23nt的dsRNA或发夹状RNA(short hair pin RNAs,shRNAs)与特异性mRNA结合导致靶基因的降解,进而导致目的产物表达的下调。本实验利用RNAi技术,探讨siRNA沉默EphA4基因表达对胃癌BGC-823细胞株生长的抑制作用及其机制,为胃癌治疗提供新靶点。
　　 材料与方法：
　　 人胃癌细胞系BGC-823细胞,购自武汉大学保藏中心,RPMI1640培养基加10％胎牛血清,5％CO237℃培养.根据人EphA4的cDNA编码序列(NM_004438EPHA4),由上海吉玛制药有限公司设计并合成三个靶基因序列；脂质体法将特异性siRNA转染入人胃癌BGC-823细胞；设立三组RNAi组,无意义组和对照组五个实验组,在转染48小时后,采用RT-PCR观察人胃癌BGC-823细胞EphA4 mRNA的表达,筛选出干扰效果最好的脂质体转染载体,用于后续试验；采用RT-PCR检测干扰效果最好的脂质体表达载体转染入人胃癌BGC-823细胞后,EphA4 mRNA表达随时间变化规律；转染后5天每天同一时间用MTT法检测三组存活的癌细胞数并计算RNAi组与无意义组的癌细胞相对生存率；在不同时间点收集转染细胞,利用流式细胞术观察siRN A抑制EphA4基因表达后诱导细胞凋亡的情况。
　　 结果：
　　 1.半定量RT-PCR结果显示转染siRNA对癌细胞EphA4 mRNA有明显抑制作用,其中以BGC823-mRNA3转染48h后效果最明显,差异具有显著性(P<0.05)。
　　 2.MTT法结果显示siRNA转染BGC-823细胞后细胞的增殖能力明显下降,与对照组相比差别显著(P<0.05)。
　　 3.EphA4表达沉默后抑制人胃癌BGC-823细胞增殖并诱导其凋亡,在24h-72h之间,增殖抑制率和凋亡率随时间延长而升高。
　　 结论：
　　 1.EphA4特异性RNAi可以有效的抑制EphA4基因的表达,并能有效诱导胃癌BGC-823细胞的凋亡,EphA4基因有望成为治疗胃癌的新靶点。
　　 2.RNAi技术对胃癌的研究、治疗有广泛的应用前景。

目录

文摘

英文文摘

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图

综述 RNAi技术及其初步应用

参考文献

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致谢