电离辐射对人外周血细胞GADD45A和nm23-H1基因表达的影响

摘要

核能和核技术的应用和扩展，给人类带来利益时，也带来危害。辐射危害评价的一个方面是辐射剂量估算。目前，染色体畸变法是进行剂量估算的首选方法，但这种方法也存在不能早期、高通量估算剂量的缺陷。因此，寻找能早期、快速、高通量的生物剂量估算法成为放射生物学者研究的热点。
　　 GADD45基因是生长抑制和DNA损伤诱导基因(Growth arrest and DNAdamage inducible genes)家族的一员，细胞内、外多种因素在转录、翻译等多个层次对其进行调节。GADD45A是一种可以被电离辐射强烈诱导，产生反应性表达改变的基因。该基因照射后的基因表达变化作为生物剂量计成为辐射学领域近年来研究的热点。
　　 nm23基因(non-metastatic23 gene)是肿瘤细胞转移抑制基因。相关研究显示，辐射对nm23-H1基因表达变化有一定影响，但这些研究大都集中于对肿瘤细胞的研究。关于该基因表达变化在肿瘤细胞和健康人外周血细胞对辐射的响应是否一致，以及辐射对人外周血细胞nm23-H1基因表达变化影响的研究均未见报道。
　　 目的
　　 采用实时RT-PCR的方法，检测X射线离体照射人外周血细胞后，GADD45A和nm23-H1基因表达水平的变化，分析两基因表达在离体照射下的量效关系以及时程变化，从而为寻找新的、特异的辐射生物标志物和剂量估算体系提供方法和实验基础。
　　 材料与方法
　　 1样本采集、照射及培养
　　 知情同意的情况下，采集4名健康人的外周血后，进行X射线照射，后分别加入1640培养液培养至0、6、12、24 h时收获细胞。
　　 2白细胞分离及RNA的提取
　　 红细胞裂解液裂解红细胞，磷酸盐缓冲液洗涤，得到的白细胞用Trizol法提取RNA。
　　 3 cDNA的合成
　　 用M-MLV逆转录酶进行反转录，合成cDNA，并将cDNA于-20℃保存，备用。
　　 4 Real-Time RT-PCR检测GADD45A和nm23-H1基因的表达
　　 以18S rRNA为内参基因检测GADD45A和nm23-H1基因的相对表达量。分析GADD45A和nm23-H1基因表达变化与照射剂量的关系，并观察时程变化。
　　 5统计学处理
　　 使用SPSS12.0统计软件对所得结果进行多组样本资料的方差分析。检验水准α=0.05。
　　 结果：
　　 1 GADD45A基因的量-效及时-效关系
　　 X射线照射后，不同时间点各剂量组GADD45A表达水平有差异(F=10.497、8.753、31.874，P<0.05)，以12 h时量-效关系较好，GADD45A表达水平随剂量增加逐渐增高，拟合量-效关系曲线方程为：Y=10-0.878+0.118X-2，R2=0.605；24 h时在2～4 Gy剂量范围内，GADD45A表达水平随剂量增加亦增高。不同剂量X射线照射后GADD45A表达水平随时间推移不断增加(F=76.431、23.771、13.797、99.805、18.834，P<0.01)。
　　 2 nm23-H1基因的量-效及间-效关系
　　 X射线照射后6 h，在1～3 Gy剂量范围内，nm23-H1表达水平随剂量增加增高(F=15.064，P<0.05)；照后12 h，在1～5 Gy剂量范围内，nm23-H1表达水平随剂量增加而增高(F=3.435，P<0.05)，拟合量-效关系曲线方程为：Y=10-0.441+0.085X，R2=0.309；照后0、24 h，各剂量组之间nm23-H1表达水平无差异(F=0.478、0.444，P>0.05)。0、4和5 Gy照射后，nm23-H1表达水平随时间的推移有降低趋势(F=8.636、4.112、5.411，P<0.05)；2和3 Gy照射后，nm23-H1表达水平于24 h降至最低点(F=12.517、6.622，P<0.05)。
　　 结论：
　　 1电离辐射离体照射能够诱导人外周血细胞GADD45A和nm23-H1基因的表达，且在不同的剂量范围内，随剂量的增加两基因表达水平增加，有一定的剂量-效应关系。
　　 2电离辐射诱导GADD45A基因表达改变的剂量-效应关系要优于nm23-H1基因。

目录

文摘

英文文摘

图和附表清单

英文缩写词表

1 引言

2 技术路线

3 仪器设备和试剂

3.1 主要仪器设备

3.2 实验用试剂

3.3 主要试剂的配制

4 材料与方法

4.1 血样采集

4.2 细胞培养和照射条件

4.3 白细胞的分离

4.4 细胞总RNA的提取

4.5 cDNA的合成

4.6 引物、探针的设计及合成

4.7 实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)

4.8 统计学处理

5 结果

5.1 细胞总RNA的鉴定

5.2 内参基因18S rRNA及目的基因GADD45A和nm23-H1的实时定量PCR扩增曲线

5.3 X线照射后GADD45A和nm23-H1基因表达改变的剂量-效应关系：

5.4 不同剂量照射后GADD45A和nm23-H1基因表达改变的时间-效应关系

6 讨论

7 结论

8 本实验的局限性和下一步的工作计划

参考文献

综述

参考文献

附录

1 电离辐射

2 小剂量辐射兴奋效应(radiation hormesis)

3 相对定量PCR的比较CT法：

个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢