基因工程神经干细胞NSCs-IGF-1治疗新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的实验研究

摘要

研究背景：
　　 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic—ischemic brain damage，HIBD)是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤的主要原因，严重危害新生儿健康，病情重，病死率和致残率高。随着新生儿科抢救水平及生命支持技术的提高，早产儿、严重窒息儿和各种脑损伤儿存活率大大提高，使得新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic—ischemic encephalopathy，HIE)的患病率不仅没有减少，反而有升高的趋势，已成为导致儿童残疾的主要疾病之一，严重影响小儿身心发育和生活质量，也给个人、家庭和社会带来了极大的精神痛苦和沉重的经济负担。传统的治疗方法如药物治疗、高压氧治疗等都仅局限于支持治疗，只能在一定程度上缓解症状，难以促进神经再生进而从根本上恢复神经系统的功能。
　　 干细胞尤其是神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的发现给HIE患者带来了新的希望。大量的研究已经证实，神经干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能而成为修复神经系统损伤的理想材料。NSCs研究成为目前生物医学领域研究的热点，而NSCs移植为治疗神经系统损伤提供了新的方向。目前对NSCs的应用研究主要集中在以下两个方面：一是将在体外分离培养并大量扩增的NSCs直接移植到神经系统损伤部位，从而起到修复作用；二是将NSCs作为载体，将有治疗作用的特定基因克隆到NSCs而制作基因工程神经干细胞，通过移植达到细胞替代和基因治疗的双重功效。
　　 研究表明胰岛素样生长因子1(Insulin—like growth factor—1，IGF—1)不仅对大脑生长、发育、髓鞘的形成有重要的作用，而且是潜在的有丝分裂源，能够在体外诱导神经细胞和血管内皮细胞的增殖、分化及调节细胞存活，同时体内外多种创伤模型也显示了其重要的神经营养及神经保护作用。有研究发现，脑损伤后立即给予IGF—1可明显减少神经元死亡，能有效改善脑损伤引起的不良后果。
　　 既往的研究显示，单独移植NSCs或IGF—1均能对HIBD动物模型发挥重要的治疗作用，促进神经功能的恢复。但将二者联合，选择IGF—1对NSCs进行基因修饰构造基因工程神经干细胞，通过细胞移植探讨对HIBD的治疗研究还未见报道。本课题旨在寻求新的NSCs来源，构造基因工程修饰神经干细胞NSCs—IGF—1，通过对移植NSCs—IGF—1的HIBD大鼠的观察，来探讨基因工程修饰神经干细胞NSCs—IGF—1治疗HIBD的可行性，为临床应用NSCs—IGF—1治疗HIBD奠定理论基础。
　　 目的：
　　 1．研究人脐带血来源的神经干细胞体外分离、培养、诱导分化及鉴定的方法，观察神经干细胞增殖、传代和分化规律，建立合适的体外稳定培养体系。
　　 2．构建IGF—1真核表达载体pcDNA3．1—IGF—1，并转染NSCs以建立基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1，为HIBD的治疗打下基础。
　　 3．探讨基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1移植对HIBD新生鼠脑部结构和功能重建的影响，为临床应用基因工程神经干细胞移植治疗HIBD提供理论支持。
　　 方法：
　　 1．无菌条件下取健康育龄产妇正常足月分娩胎儿脐带血，肝素抗凝，等体积磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后，密度梯度离心法分离其中单个核细胞。台盼蓝拒染法计数活细胞，以1×106/mL密度将脐血单个核细胞接种到培养瓶，加入含有B27、EGF和bFGF的无血清DMEM/F12培养基，37℃、5％CO2条件下培养细胞，3天后半量换液。待细胞培养至第7天，离心收集神经球，使用胰蛋白酶消化法和机械法相结合的方法进行传代，以5×105/mL将传代后的神经干细胞接种于新培养瓶，置37℃、5％CO2条件下继续培养。P3代神经干细胞加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，进行诱导分化。倒置显微镜动态观察细胞生长状况。
　　 2．加入5—溴脱氧尿嘧啶(BrdU)20μmol/L对P3代脐血神经干细胞进行标记。在37℃、5％CO2条件下培养3天后行免疫荧光化学染色检测BrdU阳性细胞，对细胞的增殖能力进行鉴定。同时对分化前后的P3代神经干细胞分别进行免疫细胞化学染色检测Nestin、NSE、GFAP和MBP的表达，对神经干细胞及其分化细胞进行鉴定。另外，对分化前的P3代脐血神经干细胞进行G418最佳筛选浓度的测定。
　　 3．从胎肝抽提总RNA，利用RT—PCR获得目的基因IGF—1。将目的基因于1％琼脂糖凝胶中进行电泳，割胶回收目的基因片段。将该目的基因与质粒pcDNA3．1进行连接构建IGF—1的真核表达重组质粒pcDNA3．1—IGF—1。用氯化钙法制备DH5a大肠杆菌感受态细胞，将连接液加入细胞进行转化，次日挑取氨苄青霉素抗性菌落进行扩增，小量制备重组质粒DNA。BamHⅠHindⅢ双酶切对重组质粒进行鉴定，同时将酶切正确的菌液进行测序鉴定。
　　 4．摇菌扩增含有目的基因的重组质粒，用SDS裂解法进行大量抽提。应用脂质体转染法将重组质粒pcDNA3．1—IGF—1转染P3代脐血神经干细胞，同时设立空质粒组和未转染对照组。G418筛选抗药性克隆进行扩大培养。并用RT—PCR检测IGF—1基因在基因转染神经干细胞中的表达，将产物经2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。免疫荧光细胞化学法检测转染细胞内IGF—1与Nestin的表达，对转染效果进行鉴定。以含20％胎牛血清的新鲜DMEM/F12培养基诱导后，免疫荧光细胞化学法检测NSE，GFAP和MBP在转染细胞中的表达，对转基因神经干细胞的分化能力进行鉴定。
　　 5．将80只SD大鼠通过结扎左颈总动脉，低氧箱中缺氧处理的方法，构建新生大鼠HIBD模型，将造模后存活的75只大鼠随机分成三组：模型对照组，NSCs移植组和NSCs—IGF—1移植组，每组25只。每组再进一步随机分为1d组、7d组、14d组、21d组及肢体运动功能检测组，每组5只。移植前3d，将基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1和未转染神经干细胞进行BrdU标记(终浓度1μmol/L)。动物模型制备24h后按1．0 mL/100g体重(细胞浓度为1×106/mL)行尾静脉注入法进行细胞移植。取25只正常SD大鼠作为正常对照组，不进行模型制作，不移植任何细胞； NSCs—IGF—1移植组为HIBD模型大鼠经尾静脉移植基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1；NSCs移植组于相同部位注入等量神经干细胞；模型对照组为HIBD大鼠注入等量生理盐水。
　　 6．各组动物每组5只分别在移植术后1d、7d、14d、21d处死，免疫荧光检测BrdU表达情况，对移植细胞在脑内的存活情况进行检测。通过Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色观察神经干细胞增殖、分化及在大鼠脑内分布情况，并通过Y—迷宫试验和运动功能检测对大鼠脑功能恢复情况进行观察研究。
　　 结果：
　　 1．原代培养的NSCs在无血清培养基中培养7d左右可形成大量悬浮的神经球，用胰蛋白酶消化法和机械法相结合的方法传代后，细胞呈散在悬浮状态，37℃5％CO2条件下培养3—5d后，又可见中等大小神经球出现在培养基中。随着传代的次数增加，细胞增殖速度逐渐减慢。P3代神经干细胞经过20％胎牛血清诱导培养1d后可见培养细胞开始贴壁，边缘出现细的突起；诱导分化第3d，贴壁细胞可见突起生长；诱导分化第7d，可以观察到神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
　　 2．P3代脐血神经干细胞进行BrdU标记后，荧光显微镜下可观察到大量BrdU表达阳性细胞。免疫细胞化学检测显示，原代及传代培养的神经干细胞Nestin表达呈阳性，而经过20％胎牛血清诱导培养7d后未见Nestin表达阳性的细胞，可见NSE，GFAP和MBP阳性细胞。同时，G418对P3代脐血神经干细胞最佳筛选浓度为400ug/mL。
　　 3．胎肝总RNA经RT—PCR后产物电泳显示在462bp处出现目的条带，目的基因IGF—1与质粒pcDNA3．1连接产物pcDN—A3．1—IGF—1经HindⅢ与BamHⅠ双酶切后，1％琼脂糖凝胶电泳显示在5428bp处和462bp处各有一条亮带，空质粒组只在5428bp处有一条亮带，结果与质粒载体及目的基因大小相符，证明所构建的真核表达载体pcDNA3．1—IGF—1大小及方向正确。对该重组体进行测序发现目的基因符合genebank序列(Nmol/L—000618)，表明真核表达载体pcDNA3．1—IGF—1成功构建。
　　 4．重组质粒pcDNA3．1—IGF—1转染神经干细胞后，加入含400ug/mL G418的筛选液筛选两天后细胞开始死亡，一周后死亡细胞达高峰，之后细胞死亡渐渐减少，并且开始分裂增殖，2周后逐渐出现抗G418的阳性克隆，但未转染细胞逐渐在含G418的筛选液中全部死亡。初步证明IGF—1基因转染神经干细胞成功。收集抗药性克隆，经过RT—PCR检测可得到一条约462bp的条带，长度与目的基因相符，证明成功构建了基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1。对此细胞行Nestin和IGF—1免疫荧光化学染色，均显示阳性，表明IGF—1在转染后的细胞中成功表达，且神经干细胞的未分化状态未因IGF—1的表达而改变。经含20％胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导7天后，可见基因转染神经干细胞克隆分化为典型的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，免疫荧光细胞化学法检测其NSE、GFAP和MBP染色阳性。
　　 5．对SD大鼠通过结扎左颈总动脉和低氧处理后，发现大鼠出现右侧肢体瘫痪，证明大鼠HIBD模型建立成功。
　　 6．基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1移植HIBD动物模型后，用免疫荧光对BrdU示踪结果显示，NSCs移植组和NSCs—IGF—1移植组均可见到BrdU阳性细胞，且在观察时间内随着细胞移植时间延长阳性细胞不断增多。静脉移植的BrdU阳性细胞可迁移至HIBD大鼠脑内并进一步趋化至左侧室管膜前下区(anterior subventricularzone，SVZa)存活下来。移植7d后，NSCs移植组和NSCs—IGF—1移植组间进行比较，BrdU阳性率差异显著(P<0．05)。
　　 7．经过HE染色，Nestin、NSE、GFAP免疫组化等方法显示移植细胞可趋化至模型动物左侧SVZa区存活并进行分化。在观测时间点内，NSCs—IGF—1移植组Nestin阳性细胞表达量早期升高，移植后14d达峰，后逐渐下降，NSE阳性细胞表达量逐渐升高。而模型对照组在移植7d后Nestin及NSE阳性细胞表达量逐渐降低，两组差异有统计学意义。各组SVZa区GFAP染色阳性细胞表达量总体逐渐升高，其中模型组表达最高，与NSCs—IGF—1移植组及正常对照组相比均有显著性差异(P<0．05)，NSCs—IGF—1移植组与正常对照组无统计学差异(P>0．05)。大鼠学习记忆功能检测及运动功能检测结果均显示NSCs—IGF—1移植组明显优于模型对照组，二者差异具有统计学意义。
　　 结论：
　　 1．人脐血可以诱导培养出神经干细胞。
　　 2．脂质体介导的转染方法能够安全有效地将IGF—1转染神经干细胞。
　　 3．成功构建基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1，并且细胞的自我更新及多向分化潜能未因IGF—1基因的转入而改变。
　　 4．基因工程神经干细胞NSCs—IGF—1移植后，细胞可以在HIBD大鼠脑内存活、增殖与分化，并对大鼠神经系统功能的恢复发挥一定作用。因此基因工程神经干细胞NScs—IGF—1有望在HIBD的治疗中发挥作用。