Pim-3基因表达下调对食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响

摘要

背景和目的
　　 食管癌是一种较为常见的恶性肿瘤，是当今世界上对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，中国是食管癌的高发区，高发区遍及我国十余个省市，尤其在河南省林州市。食管癌的发生发展是一个多阶段和多基因不断演变的过程，但对其病因及发病机理仍不十分清楚。随着医疗水平的提高，食管癌的治疗现状较过去已有明显改善，但目前术后复发率仍很高，病人五年生存率仍然十分低下，难以满足目前医疗发展的最终目标。当前兴起的靶向基因治疗已经成为对放、化疗效果不满意的肿瘤病人治疗的一种新的替代手段。因而从分子水平上探讨食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制，找到针对抑制食管鳞状细胞癌发生发展的有效的治疗靶点，对食管鳞状细胞癌的临床治疗、预防以及患者生存率和生存质量的提高都具有极其重要的意义。
　　 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pim是一种原癌基因，其蛋白激酶家族主要有三个成员，包括：Pim-1，Pim-2和Pim-3，其中Pim-3作为表达丝/苏氨酸激酶活性的原癌基因pim家族中的一员，首次在鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中作为去极化诱导基因KID-1被证实的。KID-1基因与原癌基因Pim-1和Pim-2序列高度一致，于是命名为Pim-3。研究表明，Pim-3选择性在内皮起源的器官(包括肝脏、胰腺)的恶性病变，而不是正常的组织中表达。目前，国内外研究者在肝癌、胰腺癌、结肠癌领域对Pim-3基因的研究已有较大的进展，提示其与肿瘤的发生发展密切相关。然而，迄今为止，在国内外均未见Pim-3在食管鳞状细胞癌中的研究报道，因此在本研究中，作者利用RNA干扰技术，下调食管鳞状细胞癌细胞株EC9706细胞中Pim-3的表达，通过RT-PCR和Western blotting技术研究Pim-3siRNA的转入对EC9706细胞中Pim-3 mRNA和蛋白表达的影响。利用CCK-8细胞增殖试剂盒研究下调Pim-3的表达对EC9706细胞增殖的影响，通过流式细胞术分析下调Pim-3的表达对EC9706细胞周期和细胞凋亡的影响，最后通过Real-time PCR和Western blotting技术研究与细胞增殖和细胞周期相关的基因p21以及凋亡抑制因子bcl-2和凋亡促进因子bax mRNAs和蛋白表达的变化，该研究旨在初步探讨Pim-3基因在食管鳞状细胞癌发生、发展中的可能作用，进一步为寻找靶向治疗食管鳞状细胞癌的新的分子标记奠定基础。
　　 方法
　　 1将Pim-3 siRNA和对照siRNA分别利用脂质体2000转染食管鳞状细胞癌EC9706细胞，细胞分为三组，即未处理组、对照siRNA组和Pim-3 siRNA组，分别用于下面的细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、半定量RT-PCR及Westernblotting分析。
　　 2采用新型的CCK-8试剂盒分析转染Pim-3和对照siRNAs后对食管鳞状细胞癌EC9706细胞增殖能力的影响。
　　 3运用流式细胞术检测下调Pim-3表达后，食管鳞状细胞癌EC9706细胞周期及细胞凋亡的变化。
　　 4采用半定量RT-PCR和Western blotting方法检测三组细胞中细胞增殖和周期相关因子p21以及凋亡相关因子bcl-2和bax mRNA和蛋白的表达水平的变
　　 5 RT-PCR和Western blotting结果应用Image Pro Plus5.0软件进行灰度值分析，上述所有的实验均分别重复至少三次。应用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数±标准差(x±s)表示，多个样本均数比较应用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05具有显著性。
　　 结果
　　 1 Pim-3 siRNA转染后，Pim-3基因的mRNA和蛋白表达均下降为未处理组和对照siRNA组的约1/5。未处理组和对照siRNA组之间Pim-3的表达无差异(P>0.05)。
　　 2在未处理组和对照siRNA组的EC9706细胞中，EC9706细胞的增殖没有明显差异(P>0.05)。然而，与未处理组和对照siRNA组相比，Pim-3 siRNA组在转染24h以后EC9706细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)。
　　 3细胞周期分析结果表明，未处理组和对照siRNA组中EC9706细胞在G0/G1期的细胞数比率分别为39.38％和40.25％，显著低于Pim siRNA组中G0/G1期的细胞数(60.93％)(P<0.01)，而G2/M期细胞数表现出相反的结果，即G2/M期受阻。
　　 4细胞凋亡结果表明，转染48h后，AnnexinⅤ检测的Pim-3 siRNA组细胞早期凋亡率为19.26％，显著高于未处理组和对照siRNA组的早期凋亡率(凋亡率分别为：5.15％和6.05％)(P<0.05)，而未处理组和对照siRNA组的EC9706的活细胞数分别为93.01％和91.96％，显著高于Pim-3 siRNA组的活细胞数(78.73％)(P<0.05)。
　　 5 RT-PCR和Western blotting结果表明，与未处理组和对照siRNA组相比，Pim-3 siRNA组中bcl-2 mRNA和蛋白的表达均明显下调(P<0.05)，但p21和bax mRNA和蛋白的表达水平反而明显上升，且差异具有统计学意义(P<0.05)此外，未处理组和对照siRNA组之间上述基因的表达水平均没有差异(P>0.05)。
　　 结论
　　 1利用RNA干扰技术能有效下调食管鳞状细胞癌EC9706细胞中Pim-3mRNA和蛋白的表达。
　　 2 Pim-3基因表达下调能明显抑制食管鳞状细胞癌EC9706细胞的增殖，诱导细胞周期静止在G0/G1期和细胞凋亡。
　　 3 Pim-3基因表达下调所介导的增殖抑制和周期静止可能与p21表达上调明显相关，其所介导的细胞凋亡与抑凋亡基因bcl-2表达的下调和促凋亡基因bax表达的上升密切相关。