对虾白斑综合症病毒LAMP-LFD检测方法的建立

摘要

本研究建立了WSSV的环介导等温扩增的快速检测方法(Loop-mediatedisothermal amplification，LAMP)的检测方法，并将该法与研制的FITC核酸检测侧向层析试纸(FITC nucleic acid detection lateral flow dipstick，FITC-LFD)相结合建立了更为灵敏、特异、有效、更适合实地检测的WSSV检测方法LAMP-LFD。
　　 参照GenBank上发表的WSSV基因组序列中的保守的囊膜蛋白基因VP28基因序列，设计两条特异性的引物对其进行PCR扩增，并将产物与pDM-19T连接构建重组载体pDMT-VP28；依照LAMP技术原理，利用Primer Explorer V4设计了四条引物利用构建的VP28重组载体为标准模板，优化建立了WSSV的LAMP检测方法；而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释，并以其为模板对LAMP与nested-PCR进行了检测限的比较。结果显示，WSSV-LAMP最佳反应温度为65℃、反应时间为60min；LAMP对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝、μL，而nested-PCR为100拷贝/μL，敏感性显著显著高于nested-PCR。
　　 利用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)与蛋白质亲和的作用，将其与BSA、OVA偶联；以FITC-BSA免疫BALB/c小鼠，间接ELISA测定多抗血清效价，并对血清敏感性和特异性进行鉴定以确定细胞融合备用鼠。结果显示：1号小鼠pAb效价最高，对FITC的半数抑制浓度最低，选择用1号鼠进行融合。利用杂交瘤细胞技术制备FITC单克隆抗体(Monoclonal antibody，mAb)，经筛选得到6株高度敏感特异的杂交瘤细胞；以1B11体内诱生腹水制备单克隆抗体，制备腹水效价为1/640000，半数抑制浓度IC50为7.812ng/mL，获得了效价高、特异性强的FITC-mAb。
　　 柠檬酸三钠还原法制备胶体金并将其按3μL/条的量喷至玻璃纤维塑薄膜上；以0.5mg/mL的亲和素和1 mg/mL的山羊抗鼠IgG按照1.2μL/cm得量分别标记NC膜上的检测线(T线)和控制线(C线)；组装FITC核酸检测侧向层析试纸(FITC-LFD)。利用带有生物素的引物FIP进行LAMP扩增，在反应完成前加入FITC的探针进行杂交5min，终止反应后以试纸检测，建立WSSV-LAMP-LFD检测方法；根据该试纸检测不同条件下的扩增产物得到的结果，优化得到最适检测用LAMP扩增条件；而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释，并以其为模板进行WSSV-LAMP-LFD检测。结果显示：FITC-LFD的最适检测用LAMP扩增条件为64℃，50min；该方法对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝/μL，与LAMP检测方法灵敏度相同。