腺病毒载体介导的RNAi抑制肺间质纤维化大鼠FasL基因表达的研究

摘要

背景:间质性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)是一组主要累及肺泡、细支气管和肺间质的肺部弥漫性疾病。病程进展缓慢，逐渐丧失肺功能，最终发展为弥漫性肺纤维化和蜂窝肺，导致呼吸衰竭而死亡。肺间质纤维化(pulmonaryfibrosis，PF)是最常见的肺间质疾病，也是多种肺疾病共同的结局，因其5年生存率低，因此受到国内外许多学者的关注。目前肺间质纤维化的发病机制尚未明确，关注最多的研究主要存在于两方面：一个是细胞因子，另一个是细胞凋亡。在肺间质纤维化的发病过程中有多种细胞及细胞因子参与，这些异常的成分适度凋亡有利于肺组织结构的恢复，如果凋亡不足或凋亡过度均可导致肺组织结构的破坏。Fas/FasL信号转导途径是细胞凋亡的经典途径，在肺间质纤维化发病中起到重要作用。
　　 多种实验证实在纤维化肺组织中，多种炎性细胞及肺泡、支气管上皮细胞内的Fas/FasL表达上调，故推测Fas/FasL介导的细胞凋亡与肺间质纤维化的发生有关，特别是肺组织的结构细胞的过度凋亡，引起肺组织结构改变从而引发肺间质纤维化。可溶性的Fas抗原、抗FasL抗体均能延缓博来霉素诱导的大鼠肺纤维化病变，说明通过抑制Fas/FasL信号转导途径，可能对肺纤维化具有治疗价值。
　　 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近几年迅速发展的一种生物工程技术，是指在特定因子作用下，由导入胞内的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)降解成小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调靶基因表达，是一种新的诱导基因沉默技术。
　　 目的:本实验根据大鼠的：FasL mRNA序列设计合成FasLsiRNA，并构建具有特异性阻断大鼠FasL基因的FasLsirNA-pSilencerTM2.0-U6真核表达载体，包装腺病毒，通过腺病毒载体转染肺间质纤维化大鼠，观察分析siRNA对FasLmRNA表达的抑制作用，为肺间质纤维化的防治提供理论依据。
　　 材料和方法:健康SD大鼠80只，分为空白对照组、生理盐水对照组、FasL重组复制缺陷型腺病毒治疗组，复制缺陷型腺病毒空载体组，实验第0d生理盐水对照组、治疗组、空载体组分别经气管内滴入0.4ml的博来霉素(BLM5 mg/kg)制造肺间质纤维化模型，空白对照组则滴入0.4ml的生理盐水。滴入博来霉素24h后，生理盐水组经鼻滴入生理盐水(100μl)/鼠，治疗组经鼻滴入FasL重组复制缺陷型腺病毒(AdCMV FasL)10×109空斑形成单位(pfu)(100μl)/鼠，空载体组经鼻滴入复制缺陷型腺病毒空载体(AdCMVNull)，空白对照组于24h后经鼻滴入同体积的生理盐水(100μl)/鼠。各组大鼠于实验第7、14、28d分别随机处死5只，切取肺组织做成石蜡切片，行苏木精伊红(HE)染色观察肺组织改变情况，再用免疫组织化学法检测肺组织FasL的蛋白表达水平，评价通过抑制Fas/FasL通路对肺间质纤维化的影响。
　　 结果:HE染色结果提示生理盐水组、腺病毒治疗组、空载体组各时期肺组织出现不同程度的肺泡炎和肺纤维化病理改变，但治疗组病理改变程度较生理盐水对照组及空载体组轻；免疫组化结果显示治疗组各时期肺组织FasL蛋白表达水平与生理盐水对照组及空载体对照组相比均有统计学差异(P<0.05)。
　　 结论:腺病毒介导的RNA干扰可以有效抑制大鼠肿纤维化组织FasL的表达，减轻肺纤维化程度，有望成为防治肺间质纤维化的一种手段。