microRNAs芯片筛选BMSCs神经分化过程中调控Tau蛋白表达的micro RNAs

摘要

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchyrnal Stem Cells,BMSCs)是来源于中胚层的成体干细胞,因具有多向分化能力,如脂肪细胞,软骨细胞,肌细胞,神经细胞等,而被人们期望应用临床治疗。但我们对其多向分化潜能的认识,多集中于在表面标志物的表达,对于其机制则缺乏深入的了解。基因组学的研究结果表明,各种正常细胞核内拥有的基因量相同,那么其表型和功能的差异就取决于基因表达的差异。表观遗传学所解释的就是相同的基因型是如何产生复杂表型的,主要包括DNA甲基化,组蛋白修饰,染色质重塑及microRNA调控四个方面。MicroRNAs(miRNAs)是一种小的内源性非编码RNA分子,大约由21-25个核苷酸组成,通常与一个或者多个mRNA的特定靶点结合,在翻译水平的通过抑制或断裂靶标mRNAs而调节基因的表达。
　　 Tau蛋白属于微管结合蛋白,在中枢神经系统中广泛分布,主要存在于神经元中,在其它组织中很少表达或者不表达。Tau基因位于染色体17q21,由跨越135kb的16个外显子组成。其中外显子2,3,10可被选择性剪切而形成存在于成人脑内的六种异构体。在健康成人脑内,Tau蛋白具有启动微管装配和稳定微管网络的作用,并与神经细胞信号转导和物质运输相关。由于Tau蛋白的表达量、异构体类型和磷酸化修饰程度均随着神经发育发生改变,这种时间和空间调控的方式提示Tau蛋白与神经发育相关。随后人们发现反义核苷酸抑制Tau蛋白表达后,体外培养的神经细胞不能生长轴突,Tau基因敲除鼠胚胎海马的神经干细胞在体外培养时显示出明显的轴突和树突生长延缓。现在普遍认为Tau蛋白对神经发育具有重要作用,参与轴突、树突生长和神经细胞极性形成,后者是神经细胞发育成熟的重要特征之一。
　　 本实验室在研究BMSCs的分化潜能时发现,在未分化的BMSCs中不能检测到微管相关蛋白Tau的表达,当其被诱导向神经细胞分化过程中则伴随有神经特异性微管相关蛋白Tau的表达显著增高。由于BMSCs在分化过程中的DNA序列并未发生改变,因此可从表观遗传学的角度来研究骨髓MSCs向神经细胞分化过程中Tau基因的调控机制,本实验就是从miRNAs的角度探讨BMSCs神经分化过程中miRNAs的变化并进一步探讨Tau表达的相关miRNAs调控。
　　 方法：
　　 体外分离SD大鼠骨髓间充质细胞,通过贴壁培养使细胞纯化,传至第三代时分组:诱导组和对照组。诱导组在传代24h后加入碱性成纤维生长因子(bFGF)预诱导24h,浓度10 ng／ml,然后全量换液,使用含有2％二甲基亚枫(DMSO)和200μmol／L丁羟茴醚(BHA)的诱导培养基诱导培养,5h后收集细胞；对照组不施加任何影响因素,其他步骤与诱导组相同。收集细胞后,每组各取两瓶,弃去培养基直接加入Trizol(1 ml Trizol／10cm2),反复吹打至细胞层完全溶解,干冰运输送检,使用miRNAs芯片(miRCURYTM LNA Array v.14.0)检测两组miRNAs表达图谱的差异。从所有差异表达的miRNAs图谱中寻找以编码Tau蛋白的MAPT基因为靶标的miRNAs,并随后甩real time PCR技术确认其表达变化。最后通过real time-PCR技术分别检测诱导组和对照组MAPT基因的mRNAs表达的变化情况。
　　 两组细胞分别用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE),进行神经细胞鉴定；分别进行western blot检测Tau在诱导前后表达量的变化。
　　 miRNAs数据分析采用:1.低密度筛选及数据标准化,低密度筛选后,原始信号密度用中值法标准化(挑选所有样品中密度>50的miRNAs来计算标准话因子)；2.差异超过一定数值的信号才能通过筛选。
　　 结果：
　　 (1)BMSCs被诱导后表达NSE和Tau；
　　 (2)BMSCs发生神经分化后,miRNAs芯片的检测显示:有16个miRs表达下降(>1.5倍),14个miRs明显上升(>1.2倍)；
　　 (3)miR-291a-5p和与其同簇的miR-294可能参与Tau蛋白的的表达；
　　 (4)real-time PCR检测确定miR-291a5p和miR-294的表达的确降低,
　　 结论：
　　 mo-miR-291a-5p直接或间接地参与tau相关基因MAPT的表达调控。