丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织TRPM2和EndoG的影响

摘要

背景和目的：
　　 慢性脑缺血是大脑长期处于低灌注的一种病理状态，它可导致脑细胞氧和葡萄糖供应不足，引起一系列神经功能障碍。随着世界上老龄人口所占比率不断上升，慢性脑缺血及其伴随性疾病逐渐增多，引起的认知减退和退行性神经系统疾病对生活质量和社会经济造成重大影响。故而，探讨慢性脑缺血损伤的发病机制，提出有效的预防和治疗措施迫在眉睫。
　　 瞬时感受器电位M2型(transient receptor potential melastain2，TRPM2)通道是近年来新发现的非谷氨酸依赖的阳离子通道，在中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞中均有表达，在缺血缺氧损害及各种有害因素的作用下，细胞膜上的TRPM2通道被激活，并介导钙离子的出入胞活动，导致钙超载，并诱导细胞凋亡。TRPM2作为新发现的阳离子通道，在缺血性神经系统疾病中的作用成为当前研究的热点之一。
　　 核酸内切酶G（endonuclease G，EndoG）是一种钙离子依赖性内切酶，其诱导凋亡的方式不依赖caspases途径。在慢性脑缺血损伤中，细胞内的钙超载以及缺血过程中产生的tBid、Bax能够诱导EndoG自线粒体中释放到包浆中，并随即转位至胞核中，引起线粒体断裂，导致细胞凋亡。
　　 丁基苯酞(dl-butylphthalide，NBP)对急性脑缺血具有较好的疗效，但在慢性脑缺血中是否通过影响TRPM2和EndoG而发挥神经保护作用尚未见报道。本文旨在观察丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织中TRPM2和EndoG蛋白表达的影响，深入了解丁基苯酞对慢性脑缺血脑组织的神经保护作用，为慢性脑缺血的有效预防和治疗提供理论新的思路。
　　 材料和方法
　　 选取80只质量为450-550g的清洁级Wister大鼠，7天的适应性饲养，经水迷宫测试合格后用于试验。大鼠随机分为4组，每组20只，A组：对照组（假手术）；B组：模型组（手术+溶剂）；C组：缺血丁基苯酞低剂量治疗组（手术+低剂量+溶剂）；D组：缺血丁基苯酞高剂量治疗组（手术+高剂量+溶剂）。采用双侧颈总动脉永久结扎(BCAL)，建立慢性脑缺血动物模型，术后2个月，morris水迷宫测试大鼠学习和记忆功能。A组和B组予以溶剂（消毒花生油）灌胃，C组和D组分别予以丁基苯酞60mg/kg/d、120mg/kg/d灌胃。灌胃1个月后，再次经morris水迷宫测试大鼠学习和记忆功能，然后麻醉大鼠，开胸暴露心脏，以生理盐水200ml经心脏加压快速冲洗，驱除血管内血液，断头取脑，置于4％多聚甲醛内固定24小时，常规脱水、透明、浸蜡、包埋。冠状位切片，片厚4um，HE染色观察脑组织形态学变化，免疫组化(SP)法染色检测TRPM2、EndoG的表达变化。数据以均数±标准差((?)±s)表示，SPSS13.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析(One-way.ANOVA)，两组间比较采用LSD-t检验，检验水准为α=0.05。
　　 结果
　　 1．实验动物的一般行为观察
　　 术前大鼠表现活泼，反应敏捷，能自主摄食和饮水，术后早期，B、C、D各组大鼠精神萎靡，食欲不振，少动，易激惹，A组大鼠较术前无明显变化，术后7天，各组基本情况缓慢好转。
　　 2．学习和记忆功能观察
　　 术前各组大鼠逃避潜伏期和跨越平台次数比较，差异没有统计学意义(P＞0.05)；各组模型制作(BCAL)后2个月，B组较A组逃避潜伏期明显延长，跨越平台次数明显减少，差异均有统计学意义(P＜0.05);BCAL后3个月，C组和D组逃避潜伏期缩短，跨越平台次数有所增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3．HE染色
　　 各组脑组织的颞叶皮层和海马区域均未发现明显的梗死性病灶，A组大鼠海马及颞叶皮层神经元神经元层次丰富，大部分形态正常，偶见变性坏死细胞；B组海马及颞叶皮层仅可见少量形态正常的神经元，神经元大部分变性、消失；C组海马及颞叶皮层神经元与B组相比消失减少，正常神经元数量增多；D组海马及颞叶皮层变性和死亡的神经元较B组明显恢复。
　　 4.TRPM2免疫组化染色
　　 TRPM2蛋白免疫反应产物显示为棕黄色或棕褐色着色，大部分定位于神经元包膜和胞浆中。A组皮层和海马仅可见少量TRPM2蛋白表达；B组TRPM2蛋白阳性产物显著增多；C组：TRPM2蛋白阳性产物较B组有所减少；D组TRPM2蛋白阳性产物较B组明显减少。在海马中，单因素方差分析F值为127.115，P＜0.01，差异有统计学意义；在皮层中，F值为310.046，P＜0.01，差异有统计学意义。
　　 5．EndoG免疫组化染色
　　 EndoG蛋白免疫反应产物显示为棕黄色或棕褐色着色，定位于神经元胞浆和胞核中。A组皮层和海马仅可见少量EndoG蛋白表达；B组EndpG蛋白阳性产物显著增多；C组和D组EndoG蛋白阳性产物较B组减少，其中D组下降较为明显。在海马中，单因素方差分析F值为80.292，P＜0.01，四组间差异有统计学意义：在皮层中F值为49.959，P＜0.01，四组间差异有统计学意义。
　　 结论
　　 1．丁基苯酞能减轻慢性脑缺血脑组织的形态学损害。
　　 2，丁基苯酞可能下调慢性脑缺血脑组织TRPM2蛋白和EndoG蛋白表达，抑制皮层和海马神经元的死亡、变性，发挥缺血状态下的脑保护作用。
　　 3．大剂量的丁基苯酞对慢性脑缺血脑组织的保护作用可能更强。

目录

文摘

英文文摘

缩略词

丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠脑组织TRPM2和EndoG表达的影响

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述 TRPM2、氧化应激和神经系统疾病的相关性研究进展

参考文献

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