急性髓细胞白血病细胞FLT3信号传导中P65、SMRT相互作用及靶向抑制策略的研究

摘要

急性白血病是造血系统的恶性增生性疾病,其特点为造血组织中某一血细胞系统过度增生、进入血流并侵润到各组织和器官,从而引起一系列临床症状。儿童白血病中90％以上为急性白血病,其中急性髓细胞白血病(acutemvelogenous leukemia,AML)约占急性白血病的25%～30%。目前儿童AML的治疗方法主要是规律化疗及骨髓移植等,尽管可使80%以上患儿获得临床缓解,但其5年无病生存率(disease free survival,DFS)仅在45%左右,新的治疗方法亟待开发。
　　 近年来,随着科技技术的飞速发展、基础研究的深入,人们逐渐认识到要提高白血病的疗效,必须从其发病机制着手。目前,对白血病发病机制的研究已经深入到分子水平,学者们发现白血病细胞内一些基因的异常表达,进而引起的异常信号传递可能在其发生中起重要作用。
　　 FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase3,FLT3)是Ⅲ型受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)受体家族的成员,主要表达在CD34+的造血干/祖细胞上,对造血干/祖细胞的生存、增殖和分化起重要作用,并随造血细胞的分化而消失。然而约有70%～90%的AML细胞表面存在FLT3的异常表达,包括野生型FLT3过表达和FLT3突变,而FLT3异常表达和患者的临床白细胞增多症、预后差密切相关。近年研究发现部分FLT3突变是继发于野生型FLT3过表达的,因此对于野生型FLT3的研究显得尤为重要。
　　 目前对FLT3信号传导的研究,野生型主要集中在PI3K/AKT、RAS/MAPK、SRC通路上,ITD突变型还包括STAT5通路,对在AML发生、发展中有重要作用的核因子κB(Nuclear Factor Kappa B,NF-κB)通路、核辅抑制子维甲酸/甲状腺受体沉默因子(Silencing Medtiator for Retinoic Acid and Thyroid HormoneReceptor,SMRT),研究还少有涉及。NF-κB是一类核内转录因子,它通过调节cyclinD1、c-myc等基因的转录,进而调节细胞增殖、凋亡等过程;SMRT是真核生物基因转录抑制调节的基本成分。本课题组成员前期研究证实THP-1细胞中存在FLT3、p65和SMRT的表达,FLT3抑制表达可下调THP-1细胞中NF-κB的活性;它可诱发p65因子由胞核移向胞浆,SMRT由胞浆移向胞核。推测NF-κB通路在递呈FLT3异常信号中可能起作用。鉴于单独FLT3抑制不能完全阻滞NF-κB通路活性,所以联合FLT3和NF-κB抑制可能有更好的抗白血病效应;另外FLT3/NF-κB p65/SMRT信号传导通路在AML发病中可能起重要作用。因此本研究拟在前期工作的基础上,进一步构建p65和SMRT蛋白表达载体,GST pull-down、免疫共沉淀检测两者之间相互作用,探讨NF-κB通路、SMRT在FLT3信号传递中的可能作用,并通过RNA干扰的方法下调FLT3和p65表达,体内外观察FLT3 siRNA单独、p65 siRNA单独或2者联合作用时的抗白血病效应。
　　 第一部分 NF-κB p65和SMRT相互作用
　　 目的
　　 本研究通过构建p65和SMRT真核和原核表达载体,酶切、测序正确后,细胞内外验证二者间相互作用,证实FLT3/NF-κB p65/SMRT信号传导通路的存在。
　　 方法
　　 1分别构建带有HA标签和Myc标签的人p65和SMRT蛋白的重组真核表达载体pCMV-HA-p65和pCMV-Myc-SMRT,测序、酶切鉴定正确后,通过电转系统转染THP-1细胞,免疫共沉淀后,Western Blotting验证二者间相互作用。
　　 2分别构建带有His标签和GST标签的人p65和SMRT蛋白的原核表达载体pET-32a-p65和pGEX-6p-1-SMRT,测序、酶切鉴定正确后,转化工程菌BL21,经IPTG诱导表达并纯化后,GST pull-down实验体外验证二者间相互作用。
　　 结果
　　 1重组真核表达载体pCMV-HA-p65和pCMV-Myc-SMRT经酶切、测序鉴定正确;并成功共转染THP-1细胞,抗HA和Myc多克隆抗体分别沉淀细胞裂解液,Western Blotting结果证实NF-κB p65和SMRT蛋白在细胞内存在相互作用。
　　 2重组原核表达载体pET-32a-p65和pGEX-6p-1-SMRT经酶切、测序鉴定正确,转化工程菌E.coli BL21,经诱导表达并纯化后,GST pull-down实验证实NF-κB p65和SMRT蛋白间存在相互作用。
　　 结论
　　 成功构建TNF-κB p65和SMRT蛋白的真核和原核表达载体,免疫共沉淀和GST pull-down实验证实二者间存在相互作用,证实了FLT3/NF-κB p65/SMRT信号传导通路的存在。
　　 第二部分急性髓细胞白血病细胞FLT3信号通路中靶向抑制策略的体内外研究
　　 目的
　　 分别或者联合阻断FLT3信号通路中FLT3、p65的表达,THP-1细胞株和裸鼠种植瘤模型体内观察其对下游信号分子及肿瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响,以寻找有效的白血病治疗方案。
　　 方法
　　 1将处于指数期增殖的THP-1细胞,以4×104个/ml浓度接种于96孔板中,使用不同浓度的FLT3抑制剂FLT3 inhibitor(FLT3-Ⅰ)处理细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,计算细胞增殖半数抑制浓度(IC50),进行后续试验。
　　 2 THP-1细胞转染FLT3 siRNA或用FLT3抑制剂FLT3I处理后,RT-PCR、Western blotting或流式细胞术检测FLT3信号通路各因子(FLT3、p65、IκBα、SMRT、cyclin D1)表达的变化;CCK-8法绘制细胞增殖曲线,判断细胞增殖能力变化;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,评价其作为治疗靶点的可行性。
　　 3 THP-1细胞转染p65 siRNA或用N F-κB抑制剂PN处理后,RT-PCR、Westernblotting或流式细胞术检测FLT3信号通路各因子(FLT3、p65、IκBα、SMRT、cyclin D1)表达的变化:CCK-8法绘制细胞增值曲线,判断细胞增殖能力变化:流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,评价其作为治疗靶点的可行性。
　　 4 THP-1细胞转染分别转染FLT3 siRNA、p65 siRNA或者共转染FLT3 siRNA和p65 siRNA,RT-PCR、Western blotting或流式细胞术检测FLT3信号通路各因子(FLT3、p65、IκBα、SMRT、cyclin D1)表达的变化;CCK-8法绘制细胞增殖曲线;流式细胞仪检测细胞凋亡,评价其抗白血病效应的不同。
　　 5将处于指数期生长的THP-1细胞接种到BALB/c-nude裸鼠右腋皮下,建立THP-1细胞皮下种植瘤模型。随机分4组:对照组、FLT3 siRNA治疗组、p65 siRNA治疗组及联合治疗组。治疗2周,隔日测量肿瘤体积,实验结束时处死小鼠称瘤重,计算抑瘤率。分离瘤组织,RT-PCR、Western blotting及免疫组化法检测FLT3、P65、IκBα、cyclin D1、SMRT基因和蛋白的表达:TUNEL原位杂交检测瘤组织细胞凋亡。
　　 结果
　　 1 FLT3-Ⅰ对THP-1细胞增殖有抑制作用,存在着剂量-效应关系,其作用12h的半数抑制浓度(IC50)在100nM～150nM,后续的试验中均以150nM浓度的FLT3-Ⅰ处理细胞。
　　 2 FLT3 siRNA和FLT3-Ⅰ均可有效抑制THP-1细胞中FLT3 mRNA和蛋白、cyclin D1mRNA和蛋白、核蛋白中p65、SMRT的表达(P＜0.05);并可导致细胞周期发生G0/G1期到S期的阻滞(P＜0.05),抑制细胞的增殖;同时诱导细胞凋亡,使其早期凋亡率显著增加(P＜0.05),以FLT3 siRNA的作用最为明显;但对IκBα mRNA和蛋白、p65和SMRT mRNA、总蛋白中p65和SMRT的表达无明显影响(P＞0.05)。
　　 3 P65 siRNA和PN均可有效抑制THP-1细胞中p65 mRNA和蛋白、cyclinD1mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);同时增强IκBα mRNA和蛋白、SMRTmRNA和蛋白的表达(P＜0.05);导致细胞周期发生G0/G1期到S期的阻滞(P＜0.05),抑制细胞的增殖;诱导细胞凋亡,使其早期凋亡率显著增加(P＜0.05),以p65 siRNA的作用最为明显,其中p65 siRNA亦可抑制FLT3 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05)。
　　 4 FLT3 siRNA、p65 siRNA作用后,THP-1细胞中FLT3、p65、IκBα、cyclin D1、SMRT的表达均发生了明显变化(P＜0.05),同时细胞的增殖明显受抑制,细胞的早期凋亡率显著增高(P＜0.05),以二者联合作用最为明显(P＜0.05)。
　　 5成功构建了THP-1细胞BALB/c-nude裸鼠皮下种植瘤模型,腹腔注射FLT3siRNA、p65 siRNA后,肿瘤的生长明显迟缓,瘤组织中细胞的凋亡率显著增加,以二者联合作用最为明显(P＜0.05);瘤组织中FLT3、p65、IκBα、cyclin D1、SMRT的表达有不同程度的变化,以联合作用组的疗效最为显著(P＜0.05),但均不如体外效果明显。
　　 结论
　　 1抑制FLT3及p65表达均可阻断FLT3信号通路,通过调控相关信号分子的表达,最终达到抑制AML细胞增殖并诱导其凋亡的目的。
　　 2通过对FLT3 siRNA、p65 siRNA及相对应的特异性抑制剂FLT3-Ⅰ、PN作用的比较,证实了FLT3 siRNA、p65 siRNA对AML的潜在治疗价值。
　　 3通过体内外抑制FLT3信号通路中FLT3和p65的表达,证实了多靶点联合抑制FLT3信号通路可能是治疗AML的研究方向之一。