血管紧张素Ⅱ对HepG2细胞葡萄糖代谢的影响及缬沙坦的干预作用

摘要

背景与目的：
　　 高血压和糖尿病是人类的二大杀手,二者关系密切并与心,脑血管疾病的发生有关。血管紧张素转换酶(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)和血管紧张素受体阻断剂(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)广泛用于高血压的治疗及延缓糖尿病肾病的发展。多项循证医学研究(HOPE,LIFE,VALLE及NAVIGATOR)均发现ACEI及ARB可减少新发2型糖尿病的发生。但以观察雷米普利和罗格列酮减低糖尿病前期向糖尿病转换为目的的DREAM研究,未证明雷米普利可显著减少糖尿病前期发展为糖尿病。以评价长期服用那格列奈和缬沙坦对延缓IGT患者进展为糖尿病的效果为目的的NAVIGATOR研究揭示缬沙坦(代文)可减少14％的葡萄糖耐量异常(Impaired Glucose Tolerance,IGT)发展为糖尿病。ACEI及ARB如何减少了新发糖尿病的发生及IGT向糖尿病的转化?血管紧张素2(AngiotensinⅡ,AngⅡ)对糖代谢的影响如何?ARB的代表之一:缬沙坦(代文)可否阻断其作用?AngⅡ对糖代谢的影响有无血管紧张素2受体以外的作用是本文的研究目的。
　　 除了多项循证医学观察到的现象外,AngⅡ,ACEI及ARB对葡萄糖代谢及胰岛素分泌和作用的影响已有一些研究结果。AngⅡ可影响胰岛素的信号传导,而ACEI和ARB可改善胰岛素的信号传导。此外,ACEI和ARB可促进骨骼肌毛细血管扩张,葡萄糖转运体4(Glucose Transportcr4,GLUT4)转位至细胞膜,促进骨骼肌对葡萄糖的摄取,近期的研究表明:ACEI或ARB除了减少血中游离脂肪酸水平外,还可增加血中脂联素水平。前者可导致胰岛素抵抗和肝糖输出增加,而后者可增加胰岛素的敏感性。部分ARB尚有激活PPARγ的活性,PPARγ是噻唑烷二酮的作用靶点。AngⅡ可抑制胰岛素的一相分泌,而ACEI和ARB可改善胰岛素分泌。肝脏在糖代谢中起着重要的作用,而AngⅡ对肝脏糖代谢的影响及ARB可否阻断其作用研究甚少,因而我们设计了该研究。
　　 本研究采用血管紧张素Ⅱ、缬沙坦与HepG2细胞株共同培养,了解血管紧张素Ⅱ对HepG2细胞糖代谢的影响,并观察缬沙坦在该过程中能否发挥拮抗血管紧张素Ⅱ的作用,并进一步明确血管紧张素Ⅱ影响HepG2细胞糖代谢以及缬沙坦干预作用的分子机制,为临床上同时预防和治疗高血压及糖尿病提供理论依据。
　　 方法：
　　 1.培养HepG2细胞,提取HepG2细胞总RNA,进行RT-PCR分析,确定HepG2中AngⅡ受体的存在。
　　 2.1 HepG2细胞分为:对照组,血管紧张素Ⅱ组(终浓度分别为10-3mol/L、10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mol/L),并各设平行组,分别培养48h后,每孔加入20ulMTT(5mg/ml),继续培养4h后移去原有培养液,加入150ulDMS0使结晶物溶解,用摇床震荡10min,置酶标仪,测定492nm处吸光度(0D值),以0D值反映细胞活性和数量的多少。各浓度血管紧张素Ⅱ组0D值与对照组0D值比值反映细胞存活率。
　　 2.2 HepG2细胞分组同上。各组细胞在不同浓度的AngⅡ下分别作用24h,36h,48h,GOD-POD法测各组上清葡萄糖的浓度,以不铺细胞的空白孔葡萄糖含量均值相减,得出各孔细胞的葡萄糖消耗量。比较各组间差异,确定对肝脏糖代谢作用最明显的AngⅡ的浓度和作用时间。
　　 3.HepG2细胞分为五组:对照组,血管紧张素Ⅱ组,缬沙坦组(终浓度为10-6mol.L-1),血管紧张素Ⅱ+胰岛素组(胰岛素终浓度为10-9mol.L-1),血管紧张素Ⅱ+缬沙坦组,血管紧张素Ⅱ+缬沙坦+胰岛素组,在第一步实验确定的对HepG2细胞葡萄糖消耗影响最明显的AngⅡ的浓度和作用时间的基础上,缬沙坦在加AngⅡ前2h加入细胞中,共同作用上述己确定的最佳时间,观察该条件下对HepG2细胞糖代谢糖原合成、糖异生及糖酵解各途径的干预作用。各项观察指标的测定:(糖原的合成:糖原含量/蛋白含量(umol·mg-1),糖异生:葡萄糖生成量/蛋白含量(umol·mg-1),糖酵解:乳酸生成量/蛋白量(mmol·mg-1)和丙酮酸激酶活力/蛋白量(mU·mg-1))。
　　 结果：
　　 1.AT1R在HepG2细胞上的表达,初步得到证实。
　　 2.1.AngⅡ组与对照组及各浓度组间HepG2细胞增殖差异无统计学意义,实验所用浓度范围内的AngⅡ对HepG2细胞增殖无明显影响。
　　 2.2 AngⅡ(10-5mol/l)36h时对HepG2细胞葡萄糖消耗量明显减少。不同浓度的AngⅡ对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响不同,高浓度AngⅡ较低浓度HepG2细胞葡萄糖消耗量增加。
　　 3.给予AngⅡ(10-5mol/l)后,AngⅡ组较对照组HepG2细胞葡萄糖消耗量明显减少,糖原的含量明显下降,HepG2细胞糖异生量明显增加,乳酸的生成量明显下降,丙酮酸激酶活力虽有下降,但是下降差异无统计学意义。
　　 给予缬沙坦后:①葡萄糖消耗:AngⅡ+缬沙坦组较AngⅡ组细胞葡萄糖消耗显著增加,AngⅡ+缬沙坦+胰岛素组较AngⅡ+胰岛素组和AngⅡ+缬沙坦组细胞葡萄糖消耗增加,但差异无明显统计学意义。②糖原合成:AngⅡ+缬沙坦组较AngⅡ组HepG2细胞糖原合成增加,AngⅡ+缬沙坦+胰岛素组较AngⅡ+缬沙坦组细胞糖原合成进一步增加,但较AngⅡ+胰岛素组糖原合成的量差异无统计学意义。③糖异生量:AngⅡ+缬沙坦组较AngⅡ组HepG2细胞细胞糖异生生成量明显下降,AngⅡ+缬沙坦+胰岛素组较AngⅡ+胰岛素组细胞糖异生量进一步下降,但较AngⅡ+缬沙坦组差异无统计学意义。④糖酵解:AngⅡ+缬沙坦组较AngⅡ组细胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力较AngⅡ组有所增加,但差异无统计学意义,AngⅡ+缬沙坦+胰岛素组较AngⅡ组和AngⅡ+缬沙坦组HepG2细胞乳酸生成量及丙酮酸激酶活力均明显升高但较AngⅡ+胰岛素组乳酸生成量增加,丙酮酸激酶活力差异无统计学意义。
　　 结论：
　　 1.HepG2细胞可以扩增出AT1R条带,AT1R在HepG2细胞上的表达初步得到证实。
　　 2.不同浓度AngⅡ对HepG2细胞葡萄糖消耗量的影响不同,AngⅡ(10-6mol/l)36h时对HepG2细胞葡萄糖消耗量明显减少。高浓度AngⅡ可促进HepG2细胞葡萄糖消耗量。
　　 3.AngⅡ对HepG2细胞葡萄糖消耗的影响与细胞的增殖无关,主要通过抑制糖原合成和糖酵解及促进糖异生途径,降低HepG2细胞葡萄糖消耗。
　　 4.缬沙坦在AngⅡ作用的HepG2细胞糖代谢中主要是通过促进HepG2细胞糖原合成和抑制细胞糖异生发挥其干预作用。