100株结核菌rpoB与rpoC基因突变特征及Spoligotyping基因分型的初步究

摘要

耐多药结核分枝杆菌在世界范围内的快速传播,致使结核病重新变成威胁人类生命健康的最普遍的疾病之一。根据世界卫生组织2011年报告显示,2010年在世界范围内新增880万结核分枝杆菌感染者,其中90至110万的感染者感染结核后死亡,另外有约35万的HIV阳性感染者死于结核病。利福平是抗结核病治疗方案中的一线抗菌药物,它具有快速杀菌的作用,临床结核分枝杆菌对利福平的耐药常常导致治疗失败。耐利福平菌株90％以上也耐异烟肼,所以对利福平的耐药性也被认为是耐多药结核菌的最主要标志之一。
　　 以100株临床分离株(其中75株为利福平耐药株,25株为敏感株)为研究对象,调查目前公认的利福平药物作用靶点rpoB基因的突变情况。临床分离株取自中国疾病预防控制中心结核病研究室保藏的近几年来从福建、贵州、上海、西藏、辽宁,陕西六省市临床结核病例中分离出的菌株。对100株结核分枝杆菌临床菌株rpoB基因509个bp(包括81bp的耐药决定区在内)目的片段进行PCR扩增,测序,结果表明:75株耐药菌株中,59株(78.67%)rpoB基因发生了突变,16株(21.33%)未发现有突变。25株敏感菌株中1株(4%)发生了突变。共有20种突变基因型,其中47株耐药菌株为单突变,10株耐药菌株为双密码子突变,另外2株为三密码子突变。单突变菌株中有45株的突变发生在RRDR区,另外两株突变分别发生在572和593密码子上。双密码子突变菌株中,有6株突变点均在RRDR耐药决定区中,4株为rpoB RRDR区域内位点和RRDR区域外位点密码子联合突变。仅1株敏感菌株单位点双突变,其余24株敏感型菌株未突变。在rpoB基因发生突变的菌株中除了已发现的16种单位点密码子突变和20余种双位点密码子联合突变外,新发现两种单位点密码子突变,以及九种未报道的双位点两密码子联合突变和两种新的三位点密码子突变。
　　 rpoC与rpoB同为聚合酶的亚基,据报道,rpoC在利福平耐药菌中属于补偿基因,即为了适应耐药菌的生长而引发自身的突变。目前鲜有针对临床结核分枝杆菌的rpoC基因进行的研究报道。本研究对rpoC基因中的1529bp长度的目的片段进行了PCR扩增,测序,结果表明:75株耐药菌株中,有18株(24.00%)rpoC基因发生了突变。25株敏感菌株中均未检测到有突变发生。共有7种突变基因型,全部为单密码子突变。rpoC基因突变与利福平耐药性表型之间的相关性尚需进行进一步深入研究。
　　 本研究还利用间隔寡核苷酸(spoligotyping)基因分型技术对上述75株耐药结核分枝杆菌中72株(除去LN130、SH171和GZ10058三株)进行分子遗传学分类研究。结果显示,其中60株属于北京家族基因群,占整个调查株数72株的83.33%。其中典型性北京家族基因型有57株,占整个北京家族基因群的95%,而典型性北京基因型菌株常被认为具有更大的毒性及致病性,本实验在北京基因型上的结果,对诊断、治疗北京基因型菌株引起的疾病有一定的临床指导性意义。