转BT基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析

摘要

玉米是重要的饲料、工业原料和粮食作物,全球范围的种植量仅低于于水稻和小麦。玉米对我国的国民经济具有重要意义,已经成为我国北方地区主要种植作物之一,随着经济发展和人口数量增多,我国的玉米需求量持续增长。而玉米螟一直是玉米等旱粮作物的主要害虫,在生产中造成的损失巨大。世界每年因虫害造成的损失约占农作物产量的15％以上。玉米螟可危害玉米植株地上的各个部位,使受害部分丧失功能,降低籽粒产量。传统的育种方法因育种时间长、种质资源缺乏等因素导致育种工作进展缓慢,此时基因工程育种越发受到各个国家科研人员的重视。Bt是苏云金芽孢杆菌的简称,是一种革兰氏阳性土壤芽孢杆菌。该细菌产生的Bt杀虫蛋白能够破坏昆虫肠道内的细胞渗透压,导致昆虫死亡。而Bt基因为细菌来源基因,其野生型基因不合适在高等植物中表达,从已经研究的结果来看,对野生型基因进行适当改造可以提高其在高等植物中的表达量。
　　 本研究根据植物偏爱密码子原则,改造了野生型苏云金芽孢杆菌Cry1Ab基因的编码区序列,人工合成了改造后的Cry1Ab基因编码区全序列。将改造后的基因构建到原核表达载体pET28b中,构建成原核表达载体pETAb。将这个原核表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,并进行原核诱导表达。对诱导产物进行可溶性分析,结果显示:诱导出的目的蛋白大部分以包涵体的形式存在,用CrylAb蛋白免疫试纸检测其可溶性蛋白,免疫试纸呈阳性,说明诱导表达出一定数量的可溶性Cry1Ab蛋白。提取该诱导表达的可溶性Cry1Ab蛋白,用玉米螟测试,测试结果显示:原核表达的Cry1Ab蛋白对玉米螟有较好的杀虫活性,说明本研究中人工改造的Cry1Ab基因改造正确,可以表达出具有生物活性的BT蛋白。
　　 进一步将本研究改造的Cry1Ab基因构建到植物表达载体pCPB中,构建成pCPBAb,该载体以CaMV35S启动子驱动Cry1Ab基因,另有Bar基因作为选择标记基因。利用基因枪轰击法对玉米PA×PB愈伤组织进行转化,经过筛选培养、再生培养等成功获得了53株转基因再生苗。
　　 在后期的阳性苗鉴定过程中,先用PCR在大量的再生苗中初步鉴定转基因玉米,再选取PCR为阳性的转基因玉米进行Cry1Ab蛋白的免疫试纸检测,检测结果表明:再生出的53株转基因玉米中有33株呈现PCR阳性。Cry1Ab蛋白在PCR阳性苗中并未全部都表达,33株PCR阳性植株有29株Cry1Ab蛋白表达,而且Cry1Ab蛋白的表达量并不相同,说明转基因玉米为互相独立的转化事件。对Cry1Ab蛋白表达的转化事件进行室内叶片喂虫,结果表明:转基因玉米与未转基因玉米在叶片蛀孔上差异显著,转基因玉米表现出对玉米螟的抗性叶片蛀孔小而少,而未转基因玉米蛀孔连成一片,形成一个长条形镂空虫斑。
　　 本研究成功的改造了野生型的Cry1Ab基因,并将其转到玉米中,通过阳性苗的进一步检测,获得了Cry1Ab蛋白高效表达的转化体。对转基因玉米进行生物学鉴定发现转基因玉米具有一定的玉米螟抗性。研究结果为玉米抗虫育种提供了宝贵的材料。