肾母细胞瘤血清相关炎症因子的筛选和鉴定

摘要

背景：
　　 肾母细胞瘤是小儿常见的腹部实体恶性肿瘤，又称为肾胚胎瘤，由Wilms第一次报到，故得名Wilms瘤。随着小儿外科学不断发展，对该疾病的了解也越来越深。由于肾母细胞瘤早期缺乏特异性表现，常常因病情延误而错过最佳治疗时机。近些年，越来越多的专家着手于研究肾母细胞瘤早期诊断指标，通过蛋白质组学等方法研究参与该肿瘤的特异性蛋白质。通过基因研究，发现部分缺陷基因，与该胚胎性肿瘤的发生有密切关系。部分患儿具有一定的遗传倾向。随着蛋白组学的不断发展，给恶性肿瘤的相关研究带来了曙光。表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术是近些年应用最多的蛋白组学技术，核心技术是蛋白芯片。根据芯片表面不同的修饰可分为:化学表面芯片和生物表面芯片。这些芯片可以根据蛋白质化学特性如疏水或亲水性及所带电荷而选择性地捕获特异蛋白。SELDI-TOF-MS可以高效筛选不同阶段基因表达的相关蛋白，特别是在组织与体液中，存在一些与肿瘤相关的低丰度蛋白，对于肿瘤早期筛查具有重要意义。近些年来，对于肿瘤相关炎症因子的研究也是如火如荼。结果表明，在原发灶及转移灶均发现不同类型的炎症因子。这些炎症因子直接作用于肿瘤细胞导致其发生发展还是通过刺激局部血管形成等间接方式影响肿瘤的生长，还有待进一步探讨。很多炎症因子属于蛋白质，利用蛋白组学技术研究肿瘤相关炎症因子也将会有广阔的空间。
　　 目的：
　　 通过蛋白组学技术筛选肾母细胞瘤血清可能存在的炎症因子，一方面用来区分炎症因子和与炎症因子分子量接近的血清蛋白标记物，增加相关结果的可信度，构建更为完善的早期诊断血清蛋白质指纹图谱模型。另一方面也为了判断肾母细胞瘤血清中是否存在某种炎症因子，对于后期研究炎症因子与肿瘤发生发展存在的关系具有一定指导意义。
　　 材料与方法：
　　 材料:收集我院2010年至2012年肾母细胞瘤患儿术前血清40例，其中男21例，女19例，年龄32天～8岁，平均2.9±0.1岁，术后2周血清35例（根治性手术29例，姑息性切除6例），男19例，女16例，年龄28天～8岁，平均2.8±0.1岁。术前均未接受化疗、放疗等治疗。经手术及组织穿刺活检病理诊断为肾母细胞瘤，相关结果得到2位以上的病理学专家证实。收集正常患儿血清50例，炎症患儿血清50例，与肾母细胞瘤患儿年龄、性别相匹配。清晨空腹抽取血清标本，室温静置0.5-1h，3000r/min离心15min，取上清液，然后放入-80℃冰箱保存。
　　 方法:将处理好的96孔蛋白芯片装入bioprocessor，同时每孔加入处理好的样本，并做详细记录。编辑好读片操作程序，最高分子量设为30000Da，最佳范围设为2000Da～20000Da，调置最佳激光强度及最佳检测灵敏度，并设置相应参数。每个芯片条依次装入质谱仪，利用SELDI-TOF-MAS平台，收集筛选结果。通过软件包分析处理，得到各个样本中的m/z峰，差异小于0.3％的考虑为一类。得到初步结果后，对不同组间的m/z峰值数据进行Wilcoxon秩和检验，P值越小，表达强度差异越大，对两组不同样本也越有意义。从而在肿瘤组与正常组，正常组与炎症组之间得到差异性峰值，得到的两组差异性m/z峰值，寻找近似值，范围+0.3％，进而发现在肿瘤血清中存在与炎症反应相关的蛋白峰值。收集肿瘤血清2ml，加入去离子水稀释至10ml。将蠕动泵与切向流超滤器连接好，进出管置入样本中，形成回路。另一收集管置入EP管中，收集滤液。滤液分至10个EP管中，每管约1ml，管口覆盖薄膜，留有小孔，放入-80℃冰箱充分冷冻。待充分凝固后，置入冷冻干燥机充分冻干。将干粉加入去离子水稀释至250ul。经过固相萃取技术(SPE)按30％，50％，70％，100％有机相浓度分装，并做好记录，后放入真空干燥仪中干燥至10ul，加入SampleBuffer5ul，煮沸15min，离心5000r/min，收集上清液。处理后的样本经过凝胶电泳分离，在对应的分子量轴上切胶，分装至不同EP管中，经过洗涤、脱色、干燥处理，最后加入胰蛋白酶，酶解出目标蛋白。10000r/min离心10-15min提取上清液。点样至蛋白质芯片板，放入MALDI-TOF/TOF，激光轰击后，收集相应的肽段，通过Mascot搜索软件，与SwissProt数据库进行连接、比对、匹配，进而得到目标蛋白质。
　　 结果：
　　 1.肾母细胞瘤术前组与正常组的比较结果
　　 肾母细胞瘤术前组和正常组质谱数据经过减掉基线、去噪及标准化处理，聚类分析得到各自的峰值，两组峰值经过Wilcoxon秩和检验，从而得到15个特异性m/z峰值(P＜0.01)。其中在肾母细胞瘤术前组低表达的为11个，高表达的4个。通过SVM筛选出youden指数最高的组合模型，得到m/z峰位于11118.8和11350.8蛋白标记物两个。在肾母细胞瘤术前组成高表达，表达强度分别为1219.6±476.3(m/z11118.8)和1568.0±1043.2(m/z11350.8)。在正常儿童组明显低表达，表达强度为4.8±3.5和6.3±2.9。两组比较差值具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2.炎症患儿组与正常组的比较结果
　　 炎症组与正常儿童组的质谱数据经过处理和统计学分析后，得到P＜0.01的特异性m/z峰28个，其中炎症组中高表达为6个，低表达为22个。参考youden指数最高的组合模型，得到m/z峰位于11121.4和11347.2的蛋白质标记物两个。在炎症患儿组成高表达，表达强度分别为2171.4±1247.6和3282.0±3656.9。在正常儿童组成明显低表达，表达强度为4.8±3.5和6.3±2.9。两组比较差值具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 3.肾母细胞瘤血清中与炎症相关的特异性峰值结果
　　 利用SELDI-TOF-MAS平台分别在肾母细胞瘤术前组与正常组、炎症组与正常组得到特异性峰值，通过两组结果的比较，寻找相似值，范围±0.3％，得到两个特异性蛋白峰11118.8和11350.8。结果表明在肾母细胞瘤术前血清中存在与炎症相关的蛋白峰值。在术前组成高表达，正常患儿组低表达。与术前组比较，术后2周35例血清中两种蛋白质表达均有不同程度下降。29例根治术后两种蛋白表达为4.8±4.2、6.2±4.3，与正常组比较差值无统计学意义(P＞0.05)。6例姑息性切除术后两种蛋白表达量为214.5±176.3、643.5±592.4，较术前组表达量下降，与正常组比较差值具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 4.特异性蛋白的鉴定
　　 对血清标本中目标蛋白进行分离、纯化、酶解后，利用MALDI-TOF/TOF平台对得到的肽段混合物进行检测。m/z峰位于11118.8和11350.8的蛋白质经过鉴定分别为MIF（巨噬细胞移动抑制因子）和CXCL7（趋化因子）。
　　 结论：
　　 1.m/z峰为11118.8和11350.8的蛋白质经过鉴定为MIF和CXCL7，两种炎症因子的发现能够很好的区别与其分子量接近的非炎症蛋白质标记物，构建更为完善的血清蛋白质指纹图谱模型，对肾母细胞瘤早期诊断、手术效果及预后监测具有重要意义。
　　 2.MIF和CXCL7在肾母细胞瘤血清中的发现，也证实了肿瘤血清中确实存在炎症因子。对于后期研究炎症因子与肿瘤发生、发展的关系具有一定指导意义。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

前言

材料与方法

1 临床资料

2 实验方法

结果

1 肾母细胞瘤术前组与正常组的比较结果

2 炎症患儿组与正常组的比较结果

3 肾母细胞瘤血清中与炎症相关的特异性峰值结果

4．特异性蛋白的鉴定

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历及在学期间发表的学术论文

致谢