艾叶挥发油抗乙肝病毒活性研究及其化学成分分析

摘要

艾叶为菊科多年生草本植物艾(Artemisia argyi Lévl.et Vant.)的干燥叶，我国大部分地区都有分布。艾叶是我国历史悠久的常用中药，实验证明其具有抗菌抗病毒、平喘镇咳祛痰、止血与抗凝血、抗过敏、镇静、免疫、抗自由基等药理作用。艾叶抗乙肝病毒的活性、有效部位及有效部位化学成分研究未见报道。
　　 为了研究艾叶抗乙肝病毒有效部位新药，本研究前期对艾叶不同极性提取部位进行了抗乙肝病毒活性初步筛选，发现艾叶挥发油和乙酸乙酯提取物对体外培养HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg和HBeAg有抑制作用。基于此，本课题进行了艾叶挥发油抗乙肝病毒活性的体内、外实验确证，利用正交试验法对挥发油提取工艺进行了优化。研究所用河南驻马店产艾叶挥发油化学成分未见报道，鉴于环境和气候条件的差别会对不同产地的艾叶挥发油化学成分有明显的影响，从而影响其药理活性，我们采用气相色谱-质谱联用法对其化学成分进行了分析，进一步明确了其抗乙肝病毒活性的物质基础。本研究为确定艾叶抗乙肝病毒有效部位，对建立有效成分定性、定量质控方法，并在此基础上进行艾叶抗乙肝病毒有效部位新药的研制奠定了基础。本课题完成如下研究工作:
　　 1、艾叶挥发油抗乙肝病毒活性的研究
　　 本课题首次对艾叶挥发油抗乙肝病毒活性进行研究。将不同体积浓度艾叶挥发油作用于HepG2.2.15细胞，运用MTT法检测艾叶挥发油对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)，酶联免疫测定法(ELISA)检测其对HepG2.2.15细胞分泌的表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)表达的抑制作用，以及荧光定量PCR法检测艾叶挥发油对HepG2.2.15细胞HBV-DNA拷贝数的影响。结果显示艾叶挥发油对HepG2.2.15细胞有一定毒性，半数毒性浓度(TC50)为0.069％，不同浓度的艾叶挥发油对HBsAg和HBeAg均有抑制作用，半数抑制浓度(IC50)分别为0.009％、0.011％，对HepG2.2.15细胞HBV-DNA也有抑制作用，IC50为0.014％，并呈剂量依赖性，艾叶挥发油第九天的治疗指数为HBsAg7.7，HBeAg6.3，HBV-DNA4.9。体内抗乙肝病毒实验采用雏鸭为动物模型，艾叶挥发油高中低剂量组0.02 mL/(kg·d)、0.004 mL/(kg·d)、0.0008 mL/(kg·d)，灌胃给药10 d，观察用药前(T0)与用药后(T5、T10)及停药后3d血清和肝脏中DHBV-DNA表达的抑制作用。结果表明艾叶挥发油对鸭血清和肝脏中DHBV-DNA有抑制作用。
　　 2、艾叶挥发油提取工艺的优化
　　 水蒸气蒸馏法提取艾叶挥发油，采用正交试验法，以挥发油得率为考察指标，提取时间(A)、料液比(B)、浸泡时间(C)为考察因素，每个因素设3个水平，对艾叶挥发油的提取工艺进行优选。得艾叶挥发油最佳提取工艺为:料液比1∶10，浸泡4h，蒸馏3h。
　　 3、艾叶挥发油的GC-MS分析
　　 本研究首次对河南驻马店产艾叶挥发油化学成分进行分析。应用GC-MS对其分离鉴定，归一化法测定其相对含量。检出103个色谱峰，鉴定了69个化合物，占挥发油色谱峰总面积的96.01％，其中(Z)-3-甲基-2-（2-戊烯基）-2-环戊烯-1-酮（茉莉酮）和4-(2，6，6-三甲基-1-环己烯基)-3-丁烯-2-酮（β-紫罗酮）在艾叶挥发油中首次报道。河南驻马店产艾叶挥发油的主要成分为1，8-桉叶油素(28.59％)、龙脑(7.94％)、4-甲基-1-(1-甲乙基)-3-环己烯-1-醇(6.56％)、3，3，6-三甲基-1，5-庚二烯-4-醇(6.62％)、樟脑(6.31％)、α-松油醇(3.82％)。

目录

声明

缩写词对照表

摘要

1 前言

2 实验材料、仪器与试剂

2．1 实验材料

2．2 主要仪器和试剂

3 实验方法

3．1 艾叶挥发油的提取

3．2 艾叶挥发油抗乙肝病毒活性研究

3．2．1 体外实验

3．2．2 体内试验

3．3 艾叶挥发油提取工艺的优化

3．3．1 单因素实验

3．3．2 正交试验

3．4 艾叶挥发油化学成分的GC-MS分析

3．4．1 艾叶挥发油的制备

3．4．2 GC-MS分析条件

3．4．3 图谱分析方法

3．5 数据处理

4 结果与分析

4．1 艾叶挥发油抗乙肝病毒活性研究

4．1．1 体外实验结果与分析

4．1．2 体内实验结果与分析

4．2 艾叶挥发油的提取工艺

4．2．1 单因素实验结果与分析

4．2．2 正交试验结果与分析

4．3 GC-MS结果与分析

5 讨论

5．1 艾叶挥发油抗乙肝病毒活性的研究

5．2 艾叶挥发油提取工艺的优化

5．3 艾叶挥发油化学成分GC-MS分析

6 结论和展望

6．1 结论

6．2 展望

参考文献

综述

个人简历

致谢