HL-60细胞内核干细胞因子抑制后全基因组表达谱的变化

摘要

目的:
　　 构建针对核干细胞因子(nucleostemin，NS)基因的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)慢病毒表达载体，并感染人p53缺失型白血病细胞株HL-60，确认其干扰有效后，进行基因芯片实验和后续的生物信息学分析，探讨NS抑制后全基因组表达谱的改变，为进一步探索NS非依赖p53信号通路具体机制奠定基础。
　　 方法:
　　 (1)NS-siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定:针对NS基因的序列设计RNAi有效靶点，合成含RNA干扰序列、Loop环、AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点，以及终止信号的单链DNAoligo，经退火形成双链DNA，与双酶切线性化的带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性标记的GV248慢病毒空载体进行连接产生重组慢病毒载体，转化感受态细菌，挑取重组阳性转化子进行菌落PCR反应，并对PCR阳性克隆进行测序。将重组慢病毒载体及其两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0和pHelper2.0共转染293T细胞进行病毒的包装，收集、浓缩病毒液后测定其滴度，并感染人白血病细胞株HL-60，倒置荧光显微镜下观察其转染效率，Real-timePCR检测NS基因的敲减效率。
　　 (2)基因芯片实验:以NS-siRNA重组慢病毒感染的HL-60细胞为实验组，阴性对照病毒感染的的HL-60细胞为对照组，提取细胞总RNA，纯化后进行质检，符合要求后后先逆转录为cDNA，并再次转录为带有Cy3标记的cRNA，经纯化后与芯片进行杂交反应，洗涤后进行扫描获取数据，将数据进行标准化和过滤后，以FoldChange≥2或≤0.5作为标准筛选差异表达的基因，并采用Real-timePCR对芯片结果进行验证，然后对差异表达基因行GO分析和Pathway分析，以P＜0.05为有统计学意义，且P值越小，表明显著性越强。
　　 结果:
　　 (1)经测序证实正确构建出了NS基因的RNAi重组慢病毒载体，包装、浓缩后其滴度为4×108TU/ml，荧光显微镜下显示其能有效感染HL-60细胞中，且转染效率在80％以上;Real-timePCR显示转染后NS基因mRNA表达水平较阴性对照组显著下降(P＜0.05)，抑制率为52.3％。
　　 (2)总RNA经检测后，其纯度、完整性和产量满足芯片杂交的要求。经分析后共筛选出1953个差异表达的基因，其中943个基因在实验组中表达上调，1010个基因在实验组中表达下调。Real-timePCR证实了芯片结果数据的可靠性。经分析后，差异表达的的基因可涉及多种功能和信号通路，其中内质网中蛋白质生物通路变化和金属硫蛋白的变化最为显著。
　　 结论:
　　 (1)成功构建出了NS基因的RNAi慢病毒载体，其能有效干扰人白血病细胞株HL-60中NS基因的表达。
　　 (2)HL-60细胞中NS受到抑制后生物学特性的变化较为复杂，可能涉及到多种功能蛋白、代谢和信号通路，其中上调差异表达基因Pathway分析显示内质网中蛋白质生物通路变化最为显著，而下调差异表达基因Pathway分析显示金属硫蛋白的变化较显著，提示NS抑制后HL-60细胞出现的凋亡可能与内质网压力持续存在诱导的凋亡程序有关，而增殖减弱、致瘤性减弱等变化可能与MT的下调有关，为探索NS在HL-60细胞中非p53依赖信号通路具体机制奠定了基础，但有待后续试验进一步验证。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

引言

1 实验材料

1．1 细胞系及菌株

1．2 引物序列

1．3 载体

1．4 基因芯片

1．5 主要试剂及耗材

1．6 主要仪器

1．7 主要试剂配制

1．8 主要分析软件

2 实验方法

2．1 慢病毒载体的构建

2．2 细胞培养

2．3 慢病毒载体的包装

2．4 慢病毒载体滴度测定(荧光法)

2．5 重组慢病毒载体NS-RNAi-GV248干扰效果测定

2．6 全基因组表达谱芯片技术测定NS抑制前后基因表达谱变化

2．7 基因芯片数据分析

3 结果判断

3．1 慢病毒滴度计算方法

3．2 Real-time PCR结果计算

3．3 NS基因干扰效率计算

3．4 统计学处理

4 结果

4．1 重组阳性克隆的测序结果

4．2 慢病毒载体的包装和滴度测定

4．3 重组慢病毒载体成功抑制人白血病细胞株HL-60细胞NS mRNA的表达

4．4 总RNA质检结果

4．5 基因芯片扫描图

4．6 基因芯片杂交信号标准化后数据的箱式图和散点图

4．7 差异表达基因的筛选

4．8 Real-time PCR验证芯片结果

4．9 GO分析结果

4．10 Pathway分析结果

5 讨论

5．1 慢病毒载体介导的RNAi技术的进展及优点

5．2 基因芯片技术

5．3 HL-60细胞中NS抑制后全基因组表达谱变化的初步分析

5．4 HL-60细胞中NS抑制后差异表达基因相关信号通路初步分析

6 结论

参考文献

综述 Nucleostemin的研究进展

个人简历

致谢