西格列汀对高糖刺激下大鼠骨髓内皮祖细胞增殖、迁移功能影响及机制研究

摘要

背景和目的：
　　糖尿病患者动脉粥样硬化风险明显增加，是由于高血糖造成血管内皮细胞的损伤。受损的内皮可通过来源于骨髓干细胞的归巢，分化为内皮细胞来修复。研究表明[1]，具有分化为内皮细胞的单能干细胞被命名为内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)，它的主要作用是稳定内皮的稳态和随着血管发生过程帮助新血管的形成。EPCs的损伤和减少是1型和2型糖尿病的标志性特征，尤其是2型糖尿病出现大血管并发症时，循环EPCs减少[2]，反过来加重心血管疾病的发生[3-5]，形成恶性循环。因此，EPCs数量和功能的改变在糖尿病及其大血管并发症中起重要作用，对内皮祖细胞的研究是国内外学者关注的热点。
　　胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是具有葡萄糖依赖性释放、促进餐后胰岛素分泌的肠促激素。2型糖尿病患者体内，GLP-1分泌水平或活性显著下降，且内源性GLP-1可被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)快速分解。因此，DPP-Ⅳ抑制剂——西格列汀可通过提高体内肠促胰岛素的水平、改善胰岛β细胞功能来发挥降血糖作用。
　　基质细胞衍生因子(SDF-1)具有增加循环内皮祖细胞数量的潜能和改善内皮的功能[6，7]。给严重肢体缺血的小鼠口服西格列汀后，能促进新血管生成[8]，那么西格列汀对SDF-1影响如何？西格列汀是否能调控内皮祖细胞生物学功能来调节血管生成？研究较少，机制仍不清楚。
　　本文研究体外西格列汀对高糖刺激下大鼠骨髓内皮祖细胞增殖、迁移功能的影响，探讨其改善内皮祖细胞功能的可能机制。
　　方法：
　　1.大鼠骨髓内皮祖细胞的体外培养及鉴定
　　使用密度梯度离心法和二次贴壁法联合的方法培养EPCs，通过倒置显微镜观察细胞的生长状况和形态变化。采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD133表达情况，Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-acLDL)和FITC标记的荆豆凝集素1(FITC-UEA-Ⅰ)染色以及成血管实验鉴定EPCs。
　　2.内皮祖细胞在高糖环境下培养，观察EPCs增殖、迁移及分泌SDF-1情况
　　EPCs体外培养7天后，分别于正常培养液（对照组）、不同浓度的葡萄糖培养液（5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L）环境下培养48h，MTT法检测高糖对EPCs增殖能力的影响;Boyden小室检测高糖对EPCs迁移能力的影响;ELISA法检测高糖对EPCs分泌SDF-1的影响。
　　3.内皮祖细胞在高糖环境下培养后，加入西格列汀干预，观察EPCs增殖、迁移及分泌SDF-1情况
　　EPCs于40mmol/L高糖培养液环境下培养48h后，分别以正常培养液（对照组）、含不同浓度的西格列汀培养液(0.01μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)干预48h，MTT法检测西格列汀对EPCs增殖能力的影响;Boyden小室检测西格列汀对EPCs迁移能力的影响;ELISA法检测西格列汀对EPCs分泌SDF-1的影响，评价西格列汀发挥作用的最佳浓度。
　　4.SDF-1/CXCR4信号通路在西格列汀介导的EPCs增殖、迁移功能变化中的作用
　　EPCs于40mmol/L高糖培养液环境下培养48h后，随机分为3组，A组（对照组）:只加培养液;B组:加入终浓度为1μmol/L西格列汀培养液;C组:加入终浓度为1μmol/L西格列汀及5μg/mlCXCR4受体抑制剂AMD3100(SDF-1/CXCR4通路阻滞剂）。培养48h后观察各组EPCs的增殖、迁移情况。
　　结果：
　　1.刚分离提取的单个核细胞大多呈圆形悬浮生长，4天后贴壁细胞增多且成梭形，7天时可见中心为圆形细胞，周围为梭形，呈放射状的细胞集落，流式细胞学结果显示CD34、CD133有一定程度表达，大部分细胞Dil-acLDL和FITC-UEA-Ⅰ双染色阳性，matrigel成血管实验阳性，2周后可见EPCs典型的铺路石样。
　　2.与对照组相比，不同浓度的葡糖糖干预呈浓度依赖性地抑制EPCs分泌SDF-1，降低EPCs的增殖、迁移能力，且40mmol/L高糖影响下作用最强。
　　3.与对照组相比，在西格列汀1μmol/L时，促进EPCs分泌SDF-1、增殖、迁移作用最强。
　　4.西格列汀促进大鼠EPCs的增殖、迁移在SDF-1/CXCR4通路阻滞剂AMD3100存在时作用消失。
　　结论：
　　1.高糖抑制EPCs的增殖、迁移能力，减少细胞因子SDF-1分泌。
　　2.在体外培养下，DPP-Ⅳ抑制剂西格列汀可促进高糖刺激下EPCs分泌SDF-1，从而促进EPCs增殖、迁移，这种作用可能是通过SDF-1/CXCR4信号通道介导的。

目录

声明

摘要

符号说明

引言

第一部分 大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养与鉴定

前言

1 材料和方法

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

第二部分 西格列汀对高糖刺激下大鼠骨髓内皮祖细胞增殖、迁移功能影响及机制研究

前言

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 内皮祖细胞与糖尿病

个人简历、在读期间发表的论文情况

致谢