p90/CIP2A在乳腺癌中的免疫诊断价值及其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

摘要

乳腺癌是女性患者中最普遍的肿瘤之一，并且在发达国家中是由于癌症导致死亡的第二大原因。虽然近年来，通过影像学的检测使乳腺癌的早期诊断有所改善，但是在许多国家中，乳腺癌的发病率和死亡率仍然呈上升趋势。因此，筛选和鉴定有价值的生物标志物可以提高乳腺癌的诊断率以及预防乳腺癌的复发和转移，同时发现新的治疗靶点对于有效地控制侵袭性乳腺癌也是极其重要的。
　　蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase2A，CIP2A），也称为KIAA1524或者p90肿瘤相关抗原，是一个新发现的癌蛋白。据报道，它在人类肿瘤中通过稳定致癌性转录因子c-Myc的表达，抑制蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase2A，PP2A）的活性。在一些恶性肿瘤细胞中，下调p90/CIP2A的表达可以降低肿瘤细胞的增殖能力，并且减小异种移植肿瘤的生成。虽然p90/CIP2A在许多肿瘤中呈现高表达，并且其表达水平与某些肿瘤的预后相关，但是目前还没有完全揭示p90/CIP2A蛋白在肿瘤发生发展中的功能和机制。
　　首先，本研究欲探讨抗p90/CIP2A自身抗体是否可以作为诊断乳腺癌的生物标志物，通过酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在168例乳腺癌血清和88例正常人血清中检测抗p90/CIP2A自身抗体的阳性率。采用间接免疫荧光技术（indirect immunofluorescence assay，IIF）测定p90/CIP2A在HEp-2细胞中的定位。其次，通过免疫组织化学实验（immunohistochemistry， IHC）在46例乳腺癌组织和46例乳腺癌旁组织中检测p90/CIP2A蛋白的表达。此外，本课题欲研究 p90/CIP2A在乳腺癌中的生物功能和相关机制。构建p90/CIP2A shRNA表达载体，通过慢病毒法稳定转染两株三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和 LM2-4。然后，通过 MTT、克隆形成实验和流式细胞仪检测p90/CIP2A对细胞增殖能力和凋亡作用的影响，并初步测定其主要信号通路的分子磷酸化水平。
　　目的:
　　1基于临床患者和正常人群的血清和组织样本，本研究欲探讨抗p90/CIP2A抗体是否可以作为乳腺癌的免疫诊断标志物。
　　2通过构建慢病毒介导的 shRNA抑制 p90/CIP2A表达的体外细胞模型，检测p90/CIP2A在乳腺癌细胞中的生物学功能及相关机制。
　　材料与方法:
　　1研究对象
　　1.1血清及组织样本：本研究中所采用的168例乳腺癌患者血清和88例正常人血清来自美国德州大学艾尔帕索分校（University of Texas，El Paso，UTEP）肿瘤免疫研究室的血清库。血清样本最初由本研究的临床医院合作方提供，均经病人知情同意。乳腺癌血清是在病理诊断后采集的，未经化疗或放疗。对照组血清是通过同期健康体检采集的，且没有任何肿瘤的症状。本研究经UTEP评价委员会和合作机构同意。组织芯片购于Biomax公司，包括46例乳腺癌组织和46例乳腺癌旁组织。
　　1.2细胞系：SK-BR-3、MCF10A和293T细胞购于美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）。其他细胞系MDA-MB-231，LM2-4， T-47D和ZR-75-1由UTEP的Giulio Francia教授惠赠。
　　2方法
　　2.1通过ELISA、Western blotting和IIF，检测p90/CIP2A在乳腺癌血清和正常人血清中的免疫反应。通过IHC，检测p90/CIP2A在乳腺癌组织和乳腺癌旁组织中的表达。
　　2.2 shRNA慢病毒载体介导的p90/CIP2A基因沉默后，通过MTT、克隆形成实验和流式细胞仪，检测p90/CIP2A对乳腺癌细胞增殖能力和凋亡作用的影响。通过Western blotting检测细胞中的c-Myc蛋白的表达和ERK1/2磷酸化水平。
　　3统计分析
　　使用IBM SPSS21.0统计软包（SPSS Inc， USA）对实验数据进行统计分析。所有检验水准α=0.05。ELISA和 IHC中两个率的比较采用χ2检验。采用 ROC曲线评价抗 p90/CIP2A自身抗体对乳腺癌的免疫诊断价值。MTT、克隆形成实验和凋亡检测中数据以均数±标准差表示，采用两个独立样本t检验。
　　结果:
　　1抗p90/CIP2A自身抗体在乳腺癌病人血清中的阳性率
　　抗 p90/CIP2A自身抗体在乳腺癌血清中的阳性率（19.1％）高于正常血清（2.3%），差异有统计学意义（P<0.001）。此外，ELISA结果通过Western blotting进一步验证。
　　2 p90/CIP2A在HEp-2细胞中的荧光定位
　　本研究通过IIF检测，抗p90/CIP2A自身抗体表达阳性血清的免疫荧光染色定位在胞浆。通过预吸收实验，用纯化的 p90/CIP2A蛋白与同一个血清中的抗p90/CIP2A自身抗体结合，胞浆的荧光染色降低。
　　3 p90/CIP2A在乳腺癌组织中和乳腺癌旁组织中的表达
　　p90/CIP2A在乳腺癌组织中的阳性表达(100%)高于乳腺癌旁组织（28%），统计学分析有差异（P<0.001）。
　　4 RNA干涉抑制p90/CIP2A在乳腺癌细胞中稳定表达模型的建立
　　本研究利用MDA-MB-231和 LM2-4两株三阴性乳腺癌细胞作为RNA干涉抑制p90/CIP2A稳定表达的细胞模型。shRNA沉默p90/CIP2A后，在两株细胞中，p90/CIP2A的表达降低。
　　5在乳腺癌细胞中沉默p90/CIP2A的表达进而抑制细胞增殖和细胞克隆形成
　　在两株乳腺癌细胞中降低p90/CIP2A的表达可以抑制乳腺癌细胞的增殖，统计学分析有差异（P<0.05）。与MTT结果一致，抑制p90/CIP2A的表达，降低肿瘤细胞克隆形成能力，有统计学差异（P<0.05）。
　　6 p90/CIP2A的缺失促进由紫杉醇诱导乳腺癌细胞的凋亡作用
　　p90/CIP2A shRNA组中早期凋亡和晚期凋亡率的总和高于对照组，有统计学差异（P<0.05），进而表明在乳腺癌细胞中抑制p90/CIP2A的表达可以增强由紫杉醇诱导的细胞凋亡作用。
　　7抑制p90/CIP2A的表达下调c-Myc的表达，且降低ERK1/2磷酸化
　　Western blotting结果显示在两株乳腺癌细胞系中，抑制p90/CIP2A的表达， c-Myc蛋白的表达降低，并且ERK1/2磷酸化的表达水平下降，而ERK1/2总蛋白水平不变。
　　结论:
　　1抗 p90/CIP2A抗体可以作为乳腺癌筛检和免疫学诊断的一个潜在血清标志物。
　　2 p90/CIP2A作为在乳腺癌细胞增殖和凋亡中的一个起关键性作用的癌蛋白，在乳腺癌治疗中可能成为新的治疗靶点。

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英文缩略词索引

引言

一、乳腺癌流行病学

二、乳腺癌预防策略

三、乳腺癌的发病机制

四、蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子（cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A，CIP2A）

五、p90/CIP2A与肿瘤的关系

六、本研究计划及意义

第一章 抗p90/CIP2A自身抗体在乳腺癌免疫诊断中的评价

前言

技术路线

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

第二章 p90/CIP2A调节乳腺癌细胞增殖和凋亡的作用

前言

技术路线

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

本研究的创新点与不足之处

参考文献

综述： p90/CIP2A：一个潜在的肿瘤治疗靶点

个人简历、在学期间发表的学术论文及参与科研项目

致谢