MicroRNA126对人正常肝细胞葡萄糖代谢的影响

摘要

背景：
　　糖尿病是一种复杂的代谢紊乱性疾病，血糖代谢紊乱是其主要特征。研究表明，葡萄糖的代谢紊乱可能与高血糖代谢记忆、炎症反应以及线粒体功能异常有关，但有关糖尿病的具体发病机制，到目前仍不明确。
　　MicroRNAs（miRNAs）是一类序列短小的、进化上高度保守的、非编码的RNA，由20-25个单核苷酸组成。miRNAs通过与靶基因3’非编码区结合，导致mRNA降解或直接抑制mRNA的翻译，对基因转录后进行调控，从而参与许多生理病理过程的精细调节。研究发现，miRNAs在细胞增殖和凋亡、炎症反应、信号传导、细胞代谢以及肿瘤的发生发展过程中起到至关重要的作用。大量的实验证据[1]表明，miRNAs在维持机体葡萄糖的稳态和糖尿病的发展中有重要的调节作用。Anna Zampetaki等人发现在糖尿病患者的血浆中 microRNA126（miR-126）的相对表达量明显降低，提出miR-126能准确鉴别糖尿病高危者和健康人，可以作为糖尿病疾病发展的标志物。同时，我课题组在前期研究发现， miR-126在1型和2型糖尿病患者血浆中水平降低，其表达水平与炎症反应以及脂代谢紊乱等多种糖尿病危险因素相关。
　　肝脏是人体主要的葡萄糖代谢场所，在糖尿病的发生发展中起着至关重要的作用。miR-126对人正常肝细胞葡萄糖代谢的具体作用如何呢？本研究针对改变chang liver细胞miR-126的表达量，以探讨miR-126表达水平改变时对细胞胰岛素反应的敏感性和葡萄糖代谢的影响，以进一步了解糖尿病的发病机理。
　　材料和方法：
　　1．Chang liver细胞分为3组，正常对照组、negative control FAM（NC-FAM）组、microRNA inhibitor NC-FAM（IN-NC-FAM）组，分别用不同浓度10、20、40、80nM在lipofectamine2000（Lip2000)作用下转染细胞，确定最佳转染条件。
　　2．将chang liver细胞分为6组，分别为microRNA126 mimic(miR-126)组、negative control（ NC）组、microRNA126 inhibitor(In-miR-126)组、microRNA inhibitor negative control（In-NC）组、lipofectamine2000（Lip2000）组和正常细胞对照组，按照上述优化的转染条件将对应的人工合成的核苷酸序列转染入相应的细胞组。
　　3．实时荧光定量聚合酶联反应（qRT-PCR）检测各组细胞miR-126表达水平。
　　4．将步骤2中各组细胞转染后培养48h，用人工合成胰岛素（100nM）刺激12小时，用GOD-POD法测上清葡萄糖浓度，BCA法测板下层细胞蛋白浓度，蒽酮法测定细胞糖原含量，乳酸测定试剂盒测定乳酸生成量，丙酮酸激酶测试盒测定丙酮酸激酶活力，用糖原含量/蛋白含量（μmol·mg-1）表示细胞糖原合成量；在乳酸作用下，用上清葡萄糖生成量/蛋白浓度（mmol·mg-1）的值表示细胞糖异生量；在高糖环境（葡萄糖浓度11.1mmol/L）下，用乳酸生成量/蛋白浓度（mmol·mg-1）的值和丙酮酸激酶活力/蛋白浓度（U/gprot）表示细胞糖酵解量，从而观察miR-126在正常肝细胞含量不同时，对细胞葡萄糖利用率、糖原合成、糖异生以及糖酵解作用的影响。
　　结果：
　　1．在无血清无抗生素的培养基中，转染6小时，荧光显微镜下观察，FAM标记的无意对照序列（NC-FAM、IN-NC-FAM）能够有效转染人正常肝细胞，且呈浓度依赖性，确定80nM为适宜转染浓度。
　　2．qRT-PCR结果显示：miR-126组与其他各组相比较，miR-126组miR-126相对表达量明显高于其余的各实验组以及对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；In-miR-126组、NC组、In-NC组、lip2000组与正常对照组相比较miR-126的相对表达量变化无统计学意义（P＞0.05）。
　　3．将各核苷酸序列转染至对应细胞后，miR-126组较正常对照组葡萄糖消耗量下降（33.66±2.55 vs59.12±4.03 P<0.05），糖原合成量明显下降(4.35±0.33 vs8.42±0.56 P<0.05)，细胞乳酸生成量明显下降(12.28±1.72 vs22.51±1.25 P<0.05)，丙酮酸激酶活力下降(120.87±26.23 vs277.39±57.60 P<0.05)，其余各组相比较差异不显著；miR-126组与正常对照组相比糖异生量增加(17.05±0.88 vs13.05±0.41 P<0.05)， In-miR-126组与正常对照组相比较糖异生量下降（7.41±1.39 vs13.05±0.41 P<0.05），其余各组相比较无显著差异。
　　结论：
　　miR-126在人正常肝细胞过表达时，细胞葡萄糖利用率减少，对胰岛素的敏感性降低，通过减少细胞糖原合成、增加糖异生、减少乳酸生成以及丙酮酸激酶活力的途径调节肝脏葡萄糖代谢，可能增加肝糖输出。

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中英文缩写词

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 体外培养的人正常肝细胞株

2 荧光显微镜下人正常肝细胞转染效率的验证以及转染条件的优化

3 实时荧光定量聚合酶链反应（ qRT-PCR ）检测不同实验组miR-126的相对表达量

4 miR-126对人正常肝细胞葡萄糖利用率和糖原合成的影响

5 miR-126对人正常肝细胞糖异生作用的影响

6 miR-126对人正常肝细胞糖酵解作用的影响

讨论

结论

参考文献

综述: MicroRNA126的生物学研究进展

个人简历、在校期间发表的学术论文

致谢