巴多昔芬对大鼠子宫内膜异位症作用的实验研究

摘要

背景和目的：
　　子宫内膜异位症（endometriosis，EMs）是发生在育龄期妇女常见的一种雌激素依赖的慢性疾病，主要表现为慢性下腹痛、痛经和不孕。病因为子宫内膜出现在了子宫以外的部位如盆腔腹膜、卵巢、直肠阴道膈、心包膜和胸膜，甚至出现在中枢神经系统中。盆腔子宫内膜异位症在育龄期妇女中发病率为10-15％，具有疼痛、不孕症状占35-50%。
　　目前用于治疗子宫内膜异位症的药物主要目的在于减少内源性雌激素的产生，患者长期用药后出现的低雌激素症状而使这些药物在临床使用中具有一定的局限性。寻找既能抑制和消除异位病灶的生长，又可提高妊娠率和降低复发率，且副作用低，患者依从性好的临床治疗药物，是EMs临床药物治疗的目标及基础研究的方向。
　　巴多昔芬对雌激素受体作用具有组织选择性，与骨组织、血清脂质代谢、凝血系统中雌激素受体结合表现为激动剂作用，而与乳腺和子宫组织中的雌激素受体结合则表现为拮抗作用，有望成为治疗子宫内膜异位症的一种新药。本研究通过巴多昔芬治疗大鼠EMs，观察治疗前后异位病灶的肉眼形态、体积、组织病理学和大鼠体重及治疗后子宫湿重变化，并通过免疫组织化学（免疫组化）法检测大鼠EMs在位子宫内膜和异位病灶中PCNA、ER及PR的表达，评估巴多昔芬对大鼠EMs模型异位病灶的作用及分析其可能作用机制，为EMs的临床治疗提供新的理论和实验依据。
　　材料和方法：
　　1.材料
　　健康清洁级雌性未孕SD大鼠30只，鼠龄：60～90天，体重200～250g，购自河南省实验动物中心。
　　2.方法
　　观察大鼠的发情周期，选连续观察2个正常动情周期的大鼠进行建模。建模前一天给予适量的雌激素，使大鼠均处于发情期。与动情期行皮下种植 EMs模型建立。将供体大鼠的子宫内膜组织剥离后剪成5×5mm大小的片段，种植于受体大鼠的腹肌与皮下筋膜层之间，术后肌注硫酸庆大霉素0.1ml预防感染，连续3天，3周后选取建模成功20只大鼠，随机分为巴多昔芬组（3mg/kg·d灌胃，n=10）和对照组（每日等体积量的生理盐水灌胃，n=10），在用药前用游标卡尺测量并计算异位病灶的体积V1（V=0.52×长×宽×高，单位为mm3），连续用药4周后，再次用游标卡尺测量异位病灶的体积V2（计算方法同上）。观察治疗前后异位病灶形态、体积变化及大鼠体重变化和治疗后子宫湿重的变化。无菌条件下取各组大鼠在位子宫内膜与异位病灶组织，10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋,切片，HE染色光镜观察病灶腺体、间质和上皮的变化，免疫组化法测定两组大鼠EMs模型治疗后在位子宫内膜和异位病灶中增殖细胞核抗原（PCNA）、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）表达情况。
　　结果：
　　1.大鼠子宫内膜异位症模型异位病灶形成情况
　　建模3周后第二次开腹检查移植物生长情况，30只大鼠中有23只大鼠异位病灶形成，建模成功率为：76.67%（23/30）。建模成功的大鼠模型中子宫内膜异位病灶肉眼观：移植物呈囊泡样增大，内含淡黄色或清亮囊液，在囊壁表面可见有新生血管形成。
　　2.两组大鼠EMs治疗前后异位病灶肉眼形态和组织形态学变化
　　巴多昔芬治疗前，两组大鼠EMs模型异位病灶呈囊泡状增大，内含淡黄色或清亮积液，表面可见小血管。组织病理学观察可见生长良好的腺体和间质，腺体数目较在位子宫内膜少，囊腔内可见炎性细胞。用药4周后，与对照组相比，巴多昔芬组异位病灶明显萎缩，异位病灶中腺体数目减少或消失，间质内血管减少。
　　3.两组大鼠EMs治疗前后体重变化
　　治疗前两组大鼠体重：对照组(200.80±16.84) g，巴昔芬组：(202.40±17.85) g；治疗后两组大鼠体重：对照组(260.90±15.50) g，巴多昔芬组(265.50±16.44) g。治疗前后大鼠体重各组间均未见明显差异(P>0.05)。
　　4.两组大鼠EMs治疗后子宫湿重的变化
　　治疗后对照组子宫湿重:(0.77±0.16) g，巴多昔芬组子宫明显变细，子宫湿重(0.45±0.18) g，较对照组明显减轻(P<0.05)。
　　5.两组大鼠治疗前后异位病灶体积的变化
　　种植后异位病灶随时间的增长体积都有减小趋势，治疗前大鼠EMs异位病灶的体积：对照组(84.67±17.16) mm3，巴多昔芬组(84.74±12.03) mm3，两组异位病灶体积差异无统计学意义（ P>0.05），治疗后异位病灶的体积：对照组(48.09±10.59) mm3，巴多昔芬组(24.27±8.74) mm3，较对照组体积明显减少（P<0.05），较治疗前巴多昔芬组体积也明显减小（P<0.05）。
　　6.治疗后两组大鼠EMs模型异位病灶中PCNA、ER及PR蛋白的表达情况
　　免疫组化结果显示PCNA、ER和PR在大鼠异位病灶中腺上皮细胞、腔上皮细胞及间质细胞内均有表达，其中以腺上皮细胞表达为强。异位病灶对照组中PCNA、ER及PR蛋白染色平均光密度分别为：(0.282±0.044)、(0.507±0.065)、(0.493±0.053)，巴多昔芬组PCNA、ER及PR蛋白染色平均光密度的表达分别为：(0.191±0.020)、(0.233±0.034)、(0.484±0.058)。与对照组相比，巴多昔芬组异位病灶中PCNA及ER的表达量明显减少（P<0.05），而PR的表达量却未见明显的变化（P>0.05）
　　7.治疗后两组大鼠EMs模型在位子宫内膜中PCNA、ER及PR蛋白的表达情况
　　免疫组化结果显示PCNA、ER和PR在大鼠在位子宫内膜腺上皮细胞、腔上皮细胞及间质细胞内均有表达，其中以腺上皮细胞表达为强。在位子宫内膜对照组中 PCNA、ER及 PR蛋白染色平均光密度分别：(0.369±0.081)、(0.559±0.080)、（0.563±0.097），巴多昔芬组PCNA、ER及PR蛋白染色平均光密度的表达分别为(0.211±0.037)、(0.275±0.055)、(0.538±0.078)。与对照组相比，巴多昔芬组异位病灶中PCNA及ER的表达量明显减少（P<0.05），而PR的表达量却未见明显的变化（P>0.05）。
　　结论：
　　1.大鼠皮下移植子宫内膜建立大鼠EMs模型成功率高，操作简单；
　　2.巴多昔芬可明显缩小大鼠EMs异位病灶的体积；
　　3.巴多昔芬可抑制大鼠EMs模型中在位子宫内膜和异位病灶中的ER的生成；
　　4.巴多昔芬可抑制大鼠EMs模型中在位子宫内膜和异位病灶中子宫内膜的增殖；
　　5.巴多昔芬在治疗大鼠EMs模型异位病灶中没有影响PR的表达。

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引言

材料与方法

2.1 实验动物

2.2主要试剂

2.3 主要仪器与器械

2.4 实验方法与步骤

2.5 统计学方法

实验结果

3.1大鼠子宫内膜异位症模型移植物成活情况

3.2 大鼠EMs治疗前后异位病灶肉眼形态和组织形态学变化

3.3两组大鼠治疗前后体重变化

3.4两组大鼠治疗后子宫湿重的变化

3.5两组大鼠EMs治疗前后异位病灶体积的变化

3.6治疗后两组大鼠EMs模型异位病灶中PCNA、ER及PR蛋白的表达情况

3.7治疗后两组大鼠EMs模型在位子宫内膜中PCNA、ER及PR蛋白的表达情况

讨论

4.1 EMs动物模型

4.2 巴多昔芬治疗大鼠子宫内膜异位症模型的实验研究

结论

展望

参考文献

综述 子宫内膜异位症药物治疗的新进展

中英文缩略词对照表

个人简历

致谢