M2型巨噬细胞对人食管癌移植瘤脉管生成的影响

摘要

研究背景与目的：
　　食管癌发病率居恶性肿瘤第四位。我国食管癌发病率一直位于前列，全世界近50％的食管癌发生在中国，截止2015年底，我国新发食管癌患者达到了47.79万人，食管癌已然成为严重威胁人类健康的疾病之一。我国临床上常见的食管癌类型为食管鳞状细胞癌，浸润和转移是其高死亡率的原因。
　　研究表明，食管癌的发生和浸润、转移是多项因子共同协同的结果，浸润在肿瘤组织间质中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞（tumour associated macrophages，TAMs）,TAMs在不同的微环境下表现出不同的功能活化，一般分为两种：一种是经典活化的巨噬细胞，也称为M1型巨噬细胞，在肿瘤进程中对瘤细胞具有抑制和杀伤的作用；另一种是替代性活化的巨噬细胞，称为M2型巨噬细胞，具有促进肿瘤细胞增殖的作用。研究发现在胃癌、肝癌、卵巢癌等恶性肿瘤的侵袭和转移过程中都可见 M2型巨噬细胞的出现。本实验旨在探讨 M2型巨噬细胞参与食管癌脉管生成的可能机制，从而为进一步寻找抑制食管癌转移的新靶点提供理论依据。
　　方法：
　　1.将人淋巴瘤 U937单核细胞进行培养，采用免疫细胞化学标记该细胞中CD206、CD163的表达，鉴定其表型。
　　2.采用PMA及白介素-4（IL-4）将人淋巴瘤U937单核细胞诱导为单核细胞来源的M2型巨噬细胞，与食管癌 EC9706细胞共培养作为实验组，将单独培养的食管癌EC9706细胞作为对照组。
　　3.运用酶联免疫吸附测定法（ELISA）分别检测两组细胞上清液中血管内皮生长因子（VEGF）、血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的浓度。
　　4.采用Western Blot方法检测两组细胞的VEGF、VEGF-C蛋白的表达。
　　5.运用RT-PCR法检测各组细胞中VEGF、VEGF-C mRNA的表达。
　　6.采用免疫组织化学法（SP法）检测实验组与对照组移植瘤组织中VEGF、VEGF-C的表达，并运用CD206、CD163标记TAMs。
　　7.利用原位杂交法检测各组裸鼠移植瘤组织中VEGF mRNA、VEGF-C mRNA的表达。
　　8.采用免疫组化对CD31染色，标记各组裸鼠移植瘤组织中的血管，计算MVD值。
　　9.采用免疫组化对 D2-40染色，标记各组裸鼠移植瘤组织中的淋巴管，计算LMVD值。
　　10.实验数据使用SPSS17.0统计软件处理，符合正态分布的计量资料，统计分析采用均数±标准差（X±S）；阳性率的比较采用χ2检验；计量资料均数间的比较采用t检验，检验水准α=0.05。
　　结果：
　　1.人淋巴瘤U937单核细胞CD163，CD206阳性表达率均为100%。说明人淋巴瘤U937单核细胞可作为TAMs细胞继续后续实验。
　　2.人淋巴瘤U937细胞通过白介素-4诱导18h后，形态由球型逐渐变为多边形，并开始贴壁生长。
　　3. ELISA方法检测实验组细胞上清液中VEGF浓度为（104.33±0.79），对照组浓度为（99.81±0.63），两组结果进行比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。实验组VEGF-C浓度为（224.85±29.33），对照组浓度为（208.40±24.59），实验组＞对照组，具有统计学差异（P＜0.05）。
　　4.Western blot检测实验组中VEGF蛋白的表达量为（0.60±0.04），对照组 VEGF蛋白表达量为（0.19±0.02），二者比较，实验组表达量＞对照组，差异具有显著性（P＜0.05）。实验组 VEGF-C蛋白的表达量为（1.13±0.23）；对照组 VEGF-C蛋白表达量为（0.75±0.12），两者比较，实验组表达量高于对照组，差异具有显著性（P＜0.05）。
　　5.经过 RT-PCR实验检测，实验组中VEGF mRNA表达量（1.33±0.03）大于对照组（1.18±0.02），两组比较有差异（P＜0.05）；实验组VEGF-C mRNA表达量（1.38±0.06）大于对照组（1.08±0.04），两组比较有差异（P＜0.05）。
　　6.免疫组织化学检测实验组移植瘤组织中 VEGF蛋白表达率（52.41±15.26%）明显高于对照组（45.19±18.63%），两者比较具有统计学差异（P＜0.05）；实验组 VEGF-C蛋白表达率（48.23±15.32%）大于对照组（40.69±12.78%），且具有统计学差异（P＜0.05）。
　　7.免疫组化检测实验组中CD206的计数（31.22±14.27个/HP）高于对照组（26.83±12.11个/HP），差异具有显著性（P＜0.05）。实验组中CD163的计数（29.78±12.36个/HP）高于对照组（22.53±10.38个/HP），两组之间比较具有统计学意义（P＜0.05）。
　　8.原位杂交方法检测 VEGF mRNA的表达，结果实验组阳性率（31.63±13.21%）明显高于对照组，（P＜0.05）。实验组中 VEGF-C mRNA阳性率（37.51±3.59）明显高于对照组（31.27±3.12%），两组之间比较具有统计学差异（P＜0.05）。
　　9.实验组MVD值为(29.21±5.78个/HP)，对照组MVD值为(26.58±6.53个/HP)，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
　　10.实验组LMVD值为(12.13±1.37个/HP)，对照组LMVD值为(10.09±1.21个/HP)，两组比较，差异具有显著性（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.人淋巴瘤U937单核细胞作为TAMs细胞，可以促进食管癌EC9706细胞分泌VEGF、VEGF-C因子。
　　2.M2型巨噬细胞可通过VEGF、VEGF-C促进裸鼠食管癌移植瘤组织血管、淋巴管的生成。

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中英文缩写列表

引言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

实验结果

1 免疫细胞化学检测CD206、CD163在人淋巴瘤U937单核细胞中的表达

2 经IL-4诱导的人淋巴瘤U937单核细胞的一般情况

3 酶联免疫吸附法（ELISA）对两组细胞VEGF、VEGF-C浓度的检测

4 Western Blot法对各组细胞中VEGF、VEGF-C蛋白表达的检测

5 RT-PCR检测实验组与对照组中VEGF、VEGF-C mRNA的表达情况

6 食管癌移植瘤模型建立

7 免疫组织化学检测各组移植瘤组织中VEGF、VEGF-C、CD206、CD163的表达情况

8 原位杂交法检测各组移植瘤组织中VEGF、VEGF-C mRNA的表达情况

讨论

1 人淋巴瘤U937单核细胞与M2型巨噬细胞的关系

2 M2型巨噬细胞与VEGF的关系

3 M2型巨噬细胞与VEGF-C的关系

4 关于裸鼠的基本情况

5 裸鼠食管癌模型的建立

6 M2型巨噬细胞与移植瘤组织中VEGF的关系

7 M2型巨噬细胞与裸鼠食管癌移植瘤组织中VEGF-C的关系

8 CD31在各组移植瘤中表达差异的意义

9 D2-40在各组移植瘤中表达差异的意义

结论

附图

参考文献

综述:TAMs与食管癌的浸润转移的关系

个人简历

致谢