肿瘤干细胞在人黑色素瘤细胞系A375耐顺铂效应中的作用

摘要

研究背景：
　　皮肤恶性黑色素瘤是常见的一种恶性肿瘤，顺铂（cisplatin，CDDP）是治疗皮肤恶性黑色素瘤的主要化疗药物。皮肤黑色素瘤细胞对 CDDP的敏感性较低，容易对CDDP产生获得性耐药，其机制目前尚不明确。尽管许多研究对皮肤恶性黑色素瘤的耐药性进行了细致的探讨，但是肿瘤干细胞（cancer stemcells，CSCs）在上述过程中的作用并不清楚。CSCs是肿瘤组织包含的具有自我更新和分化能力的一小类细胞，对肿瘤的发生发展起着重要的作用，被认为是产生肿瘤组织的细胞。多项研究表明，CSCs是多种肿瘤细胞对化疗耐药的重要机制之一。由此我们推测，CSCs有可能是皮肤恶性黑色素瘤对CDDP产生耐药性的机制之一。
　　为确定CSCs是否参与了皮肤恶性黑色素瘤对CDDP的耐药过程，本研究首先采用人黑色素瘤细胞系A375建立了耐CDDP的人黑色素瘤细胞系（CDDP-R A375），鉴定了CDDP-R A375对CDDP的耐药性，检测了干细胞标记物的表达和CDDP-R A375的多药耐药性，采用As2O3逆转了CDDP-R A375的耐药性后，再次检测了干细胞标记物的表达和CDDP-R A375的多药耐药性。
　　实验方法：
　　1.采用大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法诱导人恶性皮肤黑色素瘤耐药细胞系CDDP-R A375。
　　2.采用细胞计数法检测了CDDP-R A375细胞的增殖能力。
　　3.采用MTT法观察了CDDP-R A375和正常A375（WTA375）细胞对CDDP、氮烯咪胺（dacarbazine,DTIC）和紫杉醇的敏感性。
　　4.荧光实时定量PCR检测了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375和WT A375细胞的表达。
　　5.MTT法检测了As2O3对CDDP-R A375和WT A375细胞的毒性。
　　6.As2O3（0.2mg/L）预处理后，MTT法观察了CDDP-R A375细胞对CDDP、氮烯咪胺（dacarbazine,DTIC）和紫杉醇敏感性的变化，并采用荧光实时定量PCR检测了SOX-2、OCT-4和CD133在CDDP-R A375细胞表达的变化。
　　实验结果：
　　1.同WT A375细胞比较，CDDP-R A375细胞的增殖能力无显著改变（P>0.05）。CDDP-R A375和WT A375细胞的倍增时间分别为38.5 h和36.2 h，两者无明显差异。
　　2.在含有CDDP（4mg/L）的培养液中，在第3、4、5和6d，CDDP-R A375细胞的增长速率显著高于WT A375细胞（P<0.05），在第1和2d，两种细胞之间的生长速率无显著差异（P>0.05）。同正常培养液中的WT A375细胞比较，含CDDP（4mg/L）培养液培养的CDDP-RA375细胞的增殖速率无显著改变（P>0.05）；CDDP浓度为0.004和0.04mg/L时，CDDP-R A375和WT A375细胞增长速率无显著差异（P>0.05），但是CDDP浓度为0.4、4和40mg/L时，CDDP-R A375细胞的生长速率显著高于WT A375细胞（P<0.01）；CDDP-R A375和WT A375对CDDP的IC50分别为62.9mg/L和4.23mg/L，耐药指数为14.87。
　　3.细胞培养液中的DTIC浓度在0.01、0.1和1mg/L时，CDDP-R A375和WT A375细胞之间的生长率无显著差异（P>0.05），DITC浓度增加为10和100mg/L时，CDDP-R A375细胞的生长率显著高于WT A375细胞（P<0.05），CDDP-R A375和WT A375对DTIC的IC50分别为1881mg/L和293mg/L，耐药指数为6.42；培养液中的紫杉醇浓度在0.001和0.01mg/L时，CDDP-R A375和WT A375细胞之间的生长率无显著差异（P>0.05），紫杉醇浓度增加为0.1、1和10mg/L时，CDDP-R A375细胞的生长率显著高于WT A375细胞（P<0.05），CDDP-R A375和WT A375对紫杉醇的IC50分别为8.2mg/L和1.6mg/L，耐药指数为5.13。
　　4.相对于WT A375细胞，CDDP-R A375细胞中SOX-2、OCT-4和CD133的表达均显著增加（P<0.05）。
　　5.0.25 mg/L的As2O3对CDDP-R A375和WTA375细胞无毒性反应，但是当浓度超过0.25mg/L时，As2O3呈现出剂量依赖性的毒性效应。
　　6.0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375对CDDP的耐药性，逆转倍数为1.81，相对逆转效率为47.5％；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375对DTIC的耐药性，逆转倍数为1.63，相对逆转效率为44.3%；0.20 mg/L的As2O3降低了CDDP-R A375对紫杉醇的耐药性，逆转倍数为1.57，相对逆转效率为43.7%；0.20 mg/L的As2O3预处理后，CDDP-R A375细胞中SOX-2、OCT-4和CD133的表达均显著降低（P<0.05）。
　　实验结论：
　　1.成功建立耐CDDP的人恶性皮肤黑色素瘤耐药细胞系CDDP-R A375。
　　2.肿瘤干细胞与人恶性皮肤黑色素瘤对 CDDP的耐药性密切相关，可能是人恶性皮肤黑色素瘤耐CDDP的机制之一。

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符号说明

前言

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 实验方法

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 获得性耐药对A375细胞增殖的影响

2.2 CDDP-R A375细胞对CDDP敏感性的测定

2.3 CDDP-R A375和WT A375对DTIC和紫杉醇敏感性的测定

2.4 SOX-2、OCT-4和CD133的表达

2.5 As2O3细胞毒性实验结果

2.6 As2O3预处理后，CDDP-R A375对CDDP、DTIC和紫杉醇的敏感性

2.7 As2O3预处理后SOX-2、OCT-4和CD133的表达

3 讨论

3.1 CDDP的结构及作用

3.2恶性黑色素瘤对CDDP耐药性的研究现状

3.3 肿瘤干细胞与CDDP耐药

3.4对CDDP耐药的人恶性黑色素瘤细胞系的建立

3.5 CDDP-R A375的鉴定

3.6 干细胞标记物的检测

3.7 CDDP-R A375细胞的多药耐药检测

小结

参考文献

综述:恶性黑色素瘤对顺铂耐药性的机制研究进展

个人简历

致谢