ALOX5AP基因启动子区CpG-SNPs及DNA甲基化与缺血性脑卒中的相关性研究

摘要

研究背景和目的：
　　脑卒中（stroke）又称脑中风，它是由于血管破裂或脑组织供血不足导致出血或血栓的形成，引起脑部出血性或缺血性损伤症状为主要临床表现的一种神经系统疾病。我国属于脑卒中的高发国家，其中缺血性脑卒中（Ischemic stroke，IS）占脑卒中的45.5％～75.9%，并且发病率呈逐年上升的趋势。
　　DeCODE研究小组通过全基因组连锁分析在冰岛人群中首次发现能引起缺血性脑卒中和心肌梗死发生的独立风险基因—5-脂氧合酶激活蛋白基因（5-lipoxygenase activating protein，ALOX5AP）。ALOX5AP基因定位于13q12-13，编码合成5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）。FLAP是5-脂氧合酶（5-lipoxyenase，5-LO）的特定激活蛋白，FLAP和5-LO结合，调节炎症介质白三烯（Leukotriene，LT）的生物合成。LT在炎症疾病的发生和发展中发挥重要作用，可激活白细胞和单核细胞，增加血管内壁的黏附和通透性等病理机制，参与动脉粥样硬化的形成。
　　随着关联研究发展到全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）时代，目前已经在欧洲人群、冰岛人群以及日本人群进行了IS的GWAS关联研究。但是，GWAS关联研究依然存在种族间的遗传异质性。因此，在后GWAS时代，应该如何进行IS的遗传关联研究面临重大挑战。
　　表观遗传学（epigenetics）为研究IS的发病机制提供了新的视角和思路。表观遗传学是基于不改变DNA序列的基础上，可遗传的基因表达的改变。DNA甲基化是表观遗传学基因表达调控的一种重要机制，它是以甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化介导，以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）为供体，将CpG二核苷酸胞嘧啶环上5号碳原子的-H被-CH3取代，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。近年来，DNA甲基化的改变导致基因表达的异常在IS发病中的作用成为新的研究热点。然而，ALOX5AP基因启动子区DNA甲基化与IS的相关性研究目前尚未见报道。
　　最新研究表明，位于基因启动子区CpG岛上的SNPs，即CpG-SNPs，该SNP恰好可以增加或去除相应的CpG位点，进而影响DNA的甲基化水平，导致等位基因特异的甲基化（Allele-specific DNA methylation，ASM）现象。因此，CpG-SNPs被认为具有调节遗传（SNP）与表观遗传（DNA甲基化）的交互作用，进而影响基因表达功能的潜在机制。目前，关于ALOX5AP基因CpG-SNPs及其与DNA甲基化的互作方面的研究尚未见报道。
　　因此，本课题提出如下假说：ALOX5AP基因启动子区的CpG-SNPs可能通过等位基因特异的甲基化（ASM）调控基因的表达，进而影响IS的遗传易感性。本研究将从遗传、表观遗传及其交互作用的新角度揭示IS的发病机制及其特点，为IS的病理学机制以及人群防治提供理论依据。
　　研究对象：
　　1.1.IS患者的选取
　　随机选取在郑州大学第一附属医院和郑州市第一人民医院神经内科自2015年3月至2016年3月住院的IS患者。
　　初始人群：IS患者40例，其中男性26例，女性14例，平均年龄61.1±13.3岁。
　　验证人群：IS患者90例，其中男性51例，女性39例，平均年龄60.5±12.5岁。
　　IS的诊断均符合中华医学会第四届修订的缺血性脑卒中的诊断标准，并经临床检查（体征、生化检验、病史、CT/MRI）确诊。
　　1.2.正常对照个体的选取
　　随机选取与IS组同期体检的、性别和年龄相匹配的、且无脑出血、栓塞性脑梗死等脑血管病史的个体作为对照组。
　　初始人群：对照组40例，其中男性18例，女性22例，平均年龄57.9±14.1岁。
　　验证人群：对照组96例，其中男性42例，女性54例，平均年龄62.5±13.2岁。
　　所有参与个体均为河南汉族且无血缘关系的人群。本研究获得郑州大学伦理委员会的批准，所有参与个体均签署知情同意书。
　　研究方法：
　　运用天根公司全血基因组提取试剂盒提取外周血基因组DNA和RNA，进行RNA反转录。首先，运用实时定量RT-PCR技术检测IS组与正常对照组外周血中ALOX5AP基因mRNA的表达水平；然后，应用重亚硫酸盐测序PCR（Bisulfite sequencing PCR，BSP）技术检测ALOX5AP基因启动子DNA甲基化水平；其次，选取ALOX5AP基因启动子区CpG岛上rs370679485、rs74043542、rs146576796、rs4073259、rs116205889、rs115053311等6个SNPs位点，采用Sanger测序技术进行基因分型；最后，对阳性关联CpG-SNP位点rs4073259采用SNaPshot技术扩大样本进行验证。
　　本研究实验数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。IS组与对照组间的定量资料采用独立样本t检验和单因素方差分析，所有数据用均数±标准差（mean±SD）表示，对各组间的等位基因频率和基因型频率的差异进行χ2检验。采用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验。以相对风险度（Odds Ratio，OR）及95%可信区间（CI）表示对疾病发生的相对危险度，检验水准为α=0.05。P<0.05具有统计学意义。运用Bivariate相关性分析方法，对IS组中的ALOX5AP基因启动子区的平均甲基化水平与其mRNA表达水平进行相关性分析。
　　结果：
　　1. IS组ALOX5AP基因的mRNA表达水平（2.23±0.31）显著高于对照组（1.03±0.25），差异具有统计学意义（P<0.05）。
　　2.检测ALOX5AP基因启动子区17个CpG位点，IS组ALOX5AP基因启动子区的DNA甲基化水平显著高于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）；性别分层分析发现，男性IS组的甲基化水平亦显著高于男性对照组（P<0.05）。
　　3. ALOX5AP基因启动子区甲基化水平与mRNA表达水平呈显著正相关（r=0.341，P=0.031）。
　　4.携带ALOX5AP基因CpG-SNP rs4073259位点的GG基因型和G等位基因的个体降低发生IS的风险（P=0.038，OR=0.415，95%CI：0.179-0.960；P=0.043，OR=0.656，95%CI：0.435~0.988）。且在隐性遗传模式中，GG基因型降低IS的发病风险（P=0.039，OR=0.471，95%CI：0.228~0.979）。
　　5.对CpG-SNP rs4073259位点AA、AG、GG基因型个体在CpG8的平均甲基化水平进行比较，发现GG基因型个体的甲基化水平显著性高于AA基因型的个体，差异具有统计学意义（P<0.05）。而GG基因型个体的mRNA表达水平显著低于AG、AA基因型的个体，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：
　　1.促炎基因ALOX5AP的过表达可能通过参与动脉壁的炎症反应介导IS的发生。
　　2. ALOX5AP基因启动子区的高甲基化与IS的发生密切相关，且呈现性别差异。
　　3. ALOX5AP基因启动子区CpG-SNP rs4073259位点对IS的发生具有保护作用，携带GG基因型及G等位基因的个体发生IS的风险降低。
　　4. ALOX5AP基因CpG-SNP rs4073259位点 G等位基因的特异性甲基化（ASM）抑制ALOX5AP基因mRNA的表达，进而影响IS的遗传易感性。