NCAN、MKL1、COMT基因多态性与河南汉族精神分裂症关联性研究

摘要

研究背景和目的：
　　精神分裂症（Schizophrenia,SZ）是一种复杂的、多样化的行为和认知异常综合症，该病主要是由于受到遗传因素或环境因素影响阻碍大脑发育过程而导致的。它是一种病因尚未明确的重型精神病，特点是常发生于青壮年期，发病较缓慢或呈亚急性，容易复发。该病在临床上多表现为行为和认知障碍及精神活动异常，在知感觉、情感等方面常常表现为不协调。其在中国的患病率为0.6％~1.2%，这之中在院病患占总住院人数的50%以上。精神分裂症表现型常呈多样化非均一性，受多对微效基因调控，同时还受着环境因素影响，遗传度为64%-80%。
　　目前，学者们主要认为多巴胺的神经传递障碍是精神类疾病的起源，但是已有很多证据表明一些大脑区域和神经回路的广泛基因突变也是造成精神病的原因之一。突触功能的干扰有可能是由于神经连接的畸形引起的，这一过程还涉及到中间神经元的性质、位置及一些不确定情况的发生等。有研究显示，神经蛋白聚糖（Neurocan，NCAN）基因、人类巨核细胞白血病因子1（Megakaryoblastic leukemia1，MKL1）基因与突触的可塑性和生长发育有关系。NCAN基因广泛表达在神经组织当中,尤其在海马体和大脑皮层的前额叶皮质区中，这些组织对于人类的认知、感觉起重要作用，国内暂未见对该基因与精神分裂症的相关研究。MKL1基因则广泛分布在三叉神经节中，对神经元的组装、迁徙起调控作用。同时，MKL1还是血清效应因子（Serum response factor,SRF）的辅助因子，共同参与调节树突的生长，及调控信号在神经元的传递，对欧洲人群的研究已见相关报道。儿茶酚胺氧位甲基化转移酶（Catechol-O-methyltransferase,COMT）是多巴胺通路当中的一种降解酶，主要分布在中枢神经系统当中，对神经信号的传递起调控作用，可以调节多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素的代谢。NCAN是近年来研究的热点，该基因突变会引起神经元的畸形，海马体的损伤等，从而影响中枢神经系统发育。MKL1突变常会导致树突不能伸长，影响神经粘连。COMT是精神类疾病研究的重点，COMT的突变常常引起大脑神经紊乱，认知出现问题，很多研究都表明该基因是精神分裂症的易感基因，国内对该基因的研究很多，但结论不一，其影响机制尚有待深入研究。
　　为了进一步探讨NCAN基因、MKL1基因、COMT基因多态性与河南精神分裂症发生的关联性，本研究选取 NCAN基因rs1064395位点、MKL1基因s6001946位点、COMT基因rs165774位点，采用病例-对照实验调查研究方法、采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP）技术，对NCAN、MKL1、COMT三基因3位点的河南汉族精神分裂症人群和正常对照人群进行基因型分布频率和等位基因分布频率的分析和探讨，并且根据性别的不同进行分层分析，运用遗传模型和连锁不平衡分析方法，运用多因子降维法（Multifactor Dimensionality Reduction，MDR）研究NCAN、MKL1、COMT三基因三位点间的交互作用。从而观察这三基因三位点对河南汉族精神分裂症的影响。
　　研究对象和方法：
　　本研究病例组共308例（177男和131女；平均年龄：37.7±12.4岁），病例来自于2010年10月至2014年4月河南省郑州市精神病医院、洛阳市荣康医院精神分裂症住院患者，均符合中国精神疾病分类与诊断标准第三版（CCMD-3）和美国精神障碍诊断与统计手册第四版（DSM-Ⅳ）诊断标准，患者精神分裂阳性症与阴性症状量表（PANSS）评分>45分。排除诊断不明、脑器质病变、神经发育迟缓、癫痫、肝肾功能不全、严重营养不良等患者；排除酒精依赖性、其它精神类药物滥用者等。
　　对照组共361名（217男和144女；平均年龄：36.2±11.6岁）选自河南省同期健康人的无关随机个体，排除家族有精神疾患或自杀者。年龄和性别在病例组和对照组间分布均无统计学差异（t=1.56，P>0.05；χ2=0.48，P>0.05）。所有研究对象均获本人或监护人知情同意。
　　本研究方法采用PCR-RLFP方法：
　　1）采集病例组和对照组外周静脉血，EDTA试剂抗凝，标准酚-氯仿法提取全基因DNA，超微量核酸蛋白测定仪检测样本 DNA的浓度和纯度；
　　2）设计并合成引物，PCR扩增目的基因片段；
　　3）采用特异性限制性内切酶酶切PCR产物；
　　4）运用2%琼脂糖凝胶电泳分离消化后的DNA片段，然后使用紫外成像系统拍照并保存记录，并分析基因型结果；
　　5）选取各位点不同基因型PCR的产物进行DNA测序验证。
　　使用SHESIS在线软件检验Hardy-Weinberg平衡及各位点间连锁不平衡性；运用SPSS17.0统计软件进行?2检验来分析基因型、等位基因和不同的遗传模型并且计算比值比（OR）和95%置信区间（95%CI）；并且分析了不同性别的基因型和等位基因的分布。基因与基因的交互作用则由多因子降维法（MDR）分析完成。统计结果均采用Bonferroni校正，检验水准α=0.0167（0.05/3）。
　　结果：
　　1.rs1064395位点、rs6001946位点、rs165774位点病例组和对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P值依次为0.067和0.093、0.086和0.981、0.660和0.711，均大于0.05）。样本具有很好的群体代表性。
　　2.NCAN基因rs1064395位点在显性模型下病例组和对照组组基因型分布差异具有统计学意义（χ2=11.93，P<0.0167），在加性模型下其分布也是存在显著性差异（χ2=7.67，P<0.0167）。MKL1基因rs6001946位点AG基因型在病例组和对照组分布差异具有统计学意义（χ2=12.30，P<0.0167），相对风险分析结果显示AG基因型是精神分裂症的易感因子。COMT基因rs165774位点GA基因型在两组间分布差异具有统计学差异（χ2=6.17，P<0.0167），相对风险分析结果：GA基因型为精神分裂症的危险因子。
　　3.性别分层分析显示，男性河南汉族群体中，NCAN基因的GA基因型为精神分裂症的易感因子（χ2=8.90，P＜0.0167）；MKL1基因的的AG基因型为精神分裂症的易感因子（χ2=12.55，P＜0.0167）；COMT基因的AA、GA基因型为精神分裂症的易感因子（χ2=7.67，P＜0.0167；χ2=6.92，P＜0.0167）。
　　4.三种基因交互作用模型中，一因子和三因子模型具有统计学意义（P=0.001），其中三因子模型交叉验证一致性为10/10。且三因子检验样本准确度为最大（60.05%）。故三因子模型为其最佳模型。系统交互树同样显示三位点存在交互作用。
　　结论：
　　1.NCAN基因rs1064395位点A等位基因、MKL1基因rs6001946位点G等位基因与COMT基因rs165774位点A等位基因为河南汉族精神分裂症发病的风险因子。
　　2.在河南汉族男性群体中，NCAN基因rs1064395位点GA基因型个体、MKL1基因rs6001946位点AG基因型个体及COMT基因rs165774位点GA基因型个体患精神分裂症的风险概率更高。
　　3.NCAN基因rs1064395、MKL16001946与COMT基因rs165774三基因三位点在河南汉族精神分裂症的发病中存在交互作用。

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前言

材料和方法

1 研究对象

2 实验用的试剂及相关仪器和耗材

3 实验方法及内容

4 统计学分析

结果

1 基因分型电泳结果

2 PCR产物测序结果

3 Hardy-Weinbery遗传平衡检测结果

4 等位基因频率分布

5 基因型频率分布结果

6 性别分层分析

7 不同遗传模式下基因型分布

8 连锁不平衡分析

9 三基因交互作用分析结果

讨论

1 各位点与精神分裂症相关性分析

2 连锁不平衡分析

3 基因交互作用

结论

参考文献

综述 : 精神分裂症相关基因易感性的研究概况

中英文缩略词索引表

致谢

个人简历