丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（磁微粒化学发光法）的开发与应用

摘要

丙型肝炎病毒感染已成为全球所面临的卫生难题之一。因此，在医学上丙型肝炎的临床检测对患者非常重要。临床上常以丙型肝炎病毒抗体作为诊断依据，常用的检测手段有酶联免疫吸附试验法、化学发光免疫法、胶体金免疫层析试验法。而这些技术手段存在着检测时间长、灵敏度低、特异性差等缺点，因此，研发一种能够提高HCV检测灵敏度和特异性、缩短检测时间的体外诊断试剂迫在眉睫。在体外诊断领域，利用磁性复合微粒的特点并将其和化学发光免疫法结合起来，开发出一种高灵敏度和特异性，操作简便快速的HCV抗体检测学手段对HCV检测是一种创新性的突破。
　　本论文研究的内容主要包括：（1）试剂盒原材料的筛选；（2）生产工艺与反应体系的研究；（3）试剂盒质控品及企业内控品的制备；（4）参考值（范围）的确定；（5）试剂盒稳定性的研究；（6）试剂盒分析性能的评估。
　　主要的研究结果如下：
　　（1）在原材料筛选方面，我们通过配对实验最终确定了伊美诺公司的产品作为本试剂盒的包被抗原和标记抗体。
　　（2）在生产工艺方面，我们最终筛选出氨基磁珠作为固相载体，并采用氨基两步法进行包被；活化和包被缓冲液为B液；活化时间为1h；包被时间为1h；包被浓度0.7μl/人份；封闭液主要组分为 Tris-HCl（pH7.4）和2％的Casein；酶浓度为1/2000，酶稀释液主要组分为PBS和3%BSA；样品稀释液为PBS和1‰Casein。阴阳性对照稀释液为含Casein的Tris-Hcl缓冲液。
　　（3）在反应体系方面，加样模式为10μl样本-20μl磁微粒-100μl样稀，加酶100μl；37℃反应，反应模式为15min+17min；加入底物混匀后1-5min测定。
　　（4）结合国家参考品的设置和本试剂的特点，我们建立了一套企业内控品，共有67份，主要包括30份阴性参比品、30份阳性参比品、6份灵敏度参比品和1份精密性参比品。
　　（5）通过用本试剂盒对592份丙肝患者阳性样本和3480例健康人阴性样本检测所得的OD进行相关分析，我们确定cut off值＝0.4*PC均值。
　　（6）在试剂稳定性方面，通过对三批成品试剂进行加速、拆分、实时稳定性考核，最终确定该产品的有效期为12个月以上（2～8℃储存），各组分拆封后至少可以使用30天。
　　（7）经过对三批成品试剂进行分析性能评估，我们得到以下结论：三批产品对企业内控品的阴性符合率、阳性符合率、灵敏度、变异均符合要求，且不同规格、不同机型检测结果没有明显区别；不同抗凝剂（EDTA-2Na或K、枸橼酸钠、肝素）对检测结果无显著影响，可以满足临床对血清/血浆样本检测的需要；其它抗体以及内源性干扰物质等对检测结果无显著影响；试剂机载稳定性：可稳定放置28天；AutoLumoA2000 Cutoff值有效期：28天；该产品与RIBA的检测一致率较高；该产品符合HCV抗体国家参考品考核要求；本试剂盒对Seracare BBI血清转换盘的检测能力与国际知名厂家HCV抗体检测试剂盒ORTHO?3.03.0 ELISA及ORTHO3.0 EnhancedSAVe相符。
　　综上，本试剂在临床检测中操作简便快速，同时各项性能指标均能达到国际标准，在国内位居前列，为国内的临床检测提供了新的技术手段。

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前言

1丙型肝炎概述

1.1 丙型肝炎病毒的流行情况

1.2 丙型肝炎病毒的结构特点

1.3 丙型肝炎病毒基因组

1.4 丙型肝炎基因型简介

1.5 丙型肝炎病毒的传播途径

2 丙型肝炎的临床诊断

2.1 丙型肝炎的临床诊断方法

2.2 抗 HCV免疫学检测方法

2.3 国内外抗-HCV的检测现状

2.4 研究目的与意义

实验材料与设备

1 实验材料

2 实验试剂

3 实验设备

4 数据的统计学分析方法

实验方法与结果

1 抗原与抗体的选择

1.1 抗原抗体的配对筛选

1.2 包被抗原与标记抗体蛋白浓度的测定

1.3 抗原及酶标抗体的质量标准

2 生产工艺与反应体系的研究

2.1 生产工艺的研究

2.2 反应体系的研究

3 试剂盒质控品及企业内控品的制备

3.1 原料处理

3.2 试剂盒阴性/阳性对照的原料选择及制备

3.3 企业内控品的制备

4 参考值（范围）的确定

5 稳定性的研究

5.1 稳定性研究的目的

5.2 稳定性的研究方法

5.3 稳定性的研究结果

6 分析性能的评估

6.1 分析性能评估的目的

6.2 分析性能评估所用的材料

6.3 分析性能评估指标

6.4 分析性能评估结果

6.5 方法学对比

6.6 分析特异性

6.7 内源性物质干扰的研究

6.8 不同抗凝剂的影响

6.9 国家参考品的检测

6.10 Seracare BBI血清转换盘检测结果

6.11 分析性能评估总结

讨论

结论

参考文献

致谢

个人简历