人溶菌酶cDNA的克隆及在CHO/dhfr细胞中的分泌性表达

摘要

本文主要根据GenBank已公布的人溶菌酶基因，采用RT-PCR的方法，从人胎盘组织中成功扩增并克隆了其cDNA,构建了人溶菌酶真核分泌性表达载体，利用脂质体共转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO/dhfr-)，筛选得到表达人溶菌酶的CHO抗性细胞株，以期得到稳定高效表达，为大规模工业化生产人溶菌酶奠定了基础。 在实验一先根据Genbank中人溶菌酶基因mRNA序列，应用oligo6.0软件设计出特异性的扩增引物；从新鲜的人胎盘组织中分离提纯总RNA，经两步法RT-PCR，先逆转录合成第一链cDNA，再用合成的特异引物进行PCR扩增，胶回收产物用T<,4>连接酶将其连接到pMD18-T载体上，转化入DH5α感受态细胞，获得阳性克隆。进一步把连接在pMD18-T载体上的人溶菌酶成熟肽的cDNA片段用限制性内切酶EcoRV和xho1双酶切，再将回收的目的条带连接到真核分泌性表达质粒pSecTag2/HygroB上。经菌液PCR和双酶切鉴定，人溶菌酶基因成功连接到表达载体上。序列分析结果同时显示，扩增产物中编码成熟肽第105位碱基有突变，GenBank中为A，本研究扩增为T，但由于位于密码子的第三位碱基，GGU并不影响甘氨酸(glysine)的翻译种类。所以，翻译后所得人溶菌酶的一级结构并没有变化。 在实验二中，利用脂质体技术，将含人溶菌酶基因的pSecTag2/HygroB-hLYZ载体和 pSV2/dhfr2DNA质粒(3:1)与脂质体按4:6比例转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-k<,1>/dhfr细胞中。经添加潮霉素B抗生素和氨甲喋呤(MTX)并撤除H、T(次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷)双筛选下，获得了24株阳性细胞克隆体。RT-PCR验证hLYZ基因已整合如基因组中，并有其mRNA的转录。随机挑选一株扩大培养并换用无血清培养基，在MTX加压下扩增DHFR基因；与此同时，随DHFR共转染的编码人溶菌酶的基因序列也随之得到扩增，进而使目的蛋白表达量得到提高，收集细胞上清培养液经Ni<'+>-Resin过柱纯化。纯化后的蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定其相对分子质量与理论值基本相符。说明人溶菌酶融合蛋白在二氢叶酸还原酶/CHO-k<,1>表达系统中得到成功表达。

目录

论文说明：中英文对照表

声明

前言

文献综述

实验一：人溶菌酶cDNA的克隆及真核表达载体的构建

实验二 人溶菌酶CHO/dhfr-细胞中的稳定表达及鉴定

结果

讨论

结论

参考文献

致谢