PDGF和ATRA对新生大鼠EGF反应性神经干细胞定向分化为神经元的影响

摘要

目的：建立简便、易行的新生大鼠海马神经干细胞体外分离培养方法并鉴定神经干细胞；探讨血小板源性生长因子(PDGF)和全反式维甲酸(ATRA)在体外对EGF反应性神经干细胞分化作用；比较PDGF和ATRA促分化作用的强弱以及二者之间是否有协同作用。 方法：(1)选取新生大鼠分离海马神经干细胞，应用含有表皮生长因子(EGF)的无血清条件培养基，采用神经细胞球形成法体外扩增神经干细胞，机械分离法连续传代，相差显微镜观察细胞形态，传3代纯化神经干细胞，绘制细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力，以免疫细胞化学法鉴定神经细胞球Nestin表达。 (2)观察不同浓度PDGF、ATRA、PDGF/ATRA联合组对EGF反应性神经干细胞分化的作用，并研究两种因子是否具有协同作用。将纯化的神经细胞球接种于6孔培养板中，贴壁后分别用不同浓度的PDGF和ATRA处理，以台盼蓝计数，BrdU标记分析细胞生长能力，用免疫细胞化学法检测分化后细胞中神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达，观察两种因子对EGF反应性神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞比例的影响。 结果：(1)从新生大鼠海马分离的细胞在含有生长因子EGF的无血清的神经干细胞基础培养液中，能形成大量悬浮的神经干细胞球，细胞生长曲线表明这些干细胞球可在体外扩增及传代培养，经免疫细胞化学鉴定，Nestin抗体标记阳性。 (2)采用免疫荧光染色法鉴定神经元、星型胶质细胞的特异性抗原。PDGF与ATRA均能提高新生大鼠EGF反应性神经干细胞分化为神经元的比例(P＜0.00357)。在神经干细胞接种到6孔板的体外诱导过程中，用PDGF和ATRA诱导的神经元最高分化率分别为28.58﹪和21.16﹪，而PDGF+ATRA联合组处理的神经元分化率显著升高至34.45﹪，明显高于对照组(P＜0.001724)。PDGF组：当PDGF浓度在20～80ng/ml之间时，随着浓度增加，分化为神经元的比例提高(P＜0.001724)，当PDGF的浓度达到80ng/ml时，神经元分化水平达到最高，当因子浓度增加至160ng/ml，神经元分化率下降。ATRA组：1μmol/LATRA诱导神经元的分化率优于10μmol/LRA。而PDGF+ATRA联合组诱导神经元分化率最高。 结论：(1)从新生大鼠海马分离培养的细胞保持了干细胞的未分化属性，具有自我更新、增殖能力和多分化潜能，表达神经上皮干细胞蛋白，是中枢神经系统的干细胞，该方法简便、易行，是进行诱导分化的良好细胞模型。 (2)体外PDGF促进新生大鼠海马EGF反应性神经干细胞分化并诱导神经元生成，促进神经元存活，ATRA也诱导EGF反应性神经干细胞向神经元分化，作用较PDGF作用弱，两种因子有协同效应。

目录

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前言

第一部分海马EGF反应性神经干细胞的分离纯化与生物学特性研究

第二部分PDGF和ATRA对新生大鼠EGF反应性神经干细胞体外诱导分化的研究

英文缩略语

附图

致谢

神经干细胞的研究进展和应用前景