趋化因子CCL20及细胞因子Il-32对肿瘤组织中Treg细胞迁移能力影响的研究

摘要

肺癌是世界范围内较为常见的一种癌症，其发病率随着环境污染和人类生活方式的改变而成上升趋势。其中，非小细胞肺癌是临床常见肺癌类型，其发病率占总肺癌人群的85％左右。食管癌是全球范围内致死率较高的癌症之一，是一种致死性极高的消化道肿瘤，其致死率位居死亡诱因第8位，且手术后5年生存率仅为20-30％。尽管随着成像技术、手术以及放疗和化疗的进步，肺癌及食管癌的治疗取得一定的进展，但是存活率并未有明显提高，这使得该类癌症的治疗面临较大挑战。
　　在人体内部，免疫系统的功能是识别和杀伤舯瘤细胞，然而，免疫系统的功能却受到了明显的抑制，大量的先天性和适应性免疫细胞参与了免疫抑制。在肿瘤免疫抑制微环境中，肿瘤细胞及肿瘤基质通过分泌趋化因子和细胞因子，招募Tregs、骨髓来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)、Th17细胞和B-Reg细胞(regulatoryB cells)等到达肿瘤组织，形成免疫抑制微环境，促进肿瘤的进展。研究表明，在许多类型原发或者转移肿瘤中如食管癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、口腔鳞癌、前列腺癌、皮肤鳞癌等，均可发现大量Tregs细胞的浸润，而且Tregs细胞水平的变化与肿瘤的预后密切相关，大量的Tregs细胞浸润，预示肿瘤的预后较差。
　　多项研究结果显示，趋化因子在免疫细胞迁移运动过程中发挥重要作用，其中，趋化因子CCL20通过与其特异性受体CCR6结合，参与Treg细胞向肿瘤部位的迁移运动，从而在在多种癌症如结直肠癌和喉鳞状细胞癌等的发生、进展及远处转移过程中发挥重要作用，逐渐受到重视，然而，关于趋化因子CCL20在非小细胞肺癌进展中的作用却尚未揭示。CXCL8是一种重要的多功能细胞因子，可通过自分泌和旁分泌途径，与其受体CXCR1和CXCR2结合，在乳腺癌、肺癌、结直肠癌和黑色素瘤等的发生、发展过程中起到非常重要的作用。而CXCL8在食管癌发展过程中作用的有关研究较少。IL-32是一种重要的前炎症因子，在癌组织高表达，通过激活NF-kB通路，刺激细胞因子如CXCL8等的释放，促进癌症的发展。趋化因子CXCL8在多种癌症中参与调节性T细胞向肿瘤组织的定向迁移运动，而IL-32是否可通过作用于CXCL8而促进食管癌的发展的相关研究较少。本课题探讨趋化因子CCL20及细胞因子IL-32在肺小细胞癌及食管鳞癌组织招募Tregs细胞的相关机制，以期对其治疗提供新的方法与思路。
　　第一部分 趋化因子CCL20在非小细胞肺癌组织部位对Treg细胞迁移运动能力影响的研究
　　目的:
　　趋化因子CCL20在Treg细胞向非小细胞肺癌组织部位归巢过程中的分子机制的研究。
　　方法:
　　2.1 RT-PCR方法检测CCL20、CD4、Foxp3、IL-10在非小细胞肺癌组织或癌旁组织中的表达;
　　2.2 采用免疫组化方法在蛋白水平检测CCL20表达水平及其主要来源细胞;
　　2.3 流式细胞术检测非小细胞肺癌组织浸润淋巴细胞(TIL)和外周血PBMC中T细胞亚群比例及CCR6在T细胞亚群表达比例;
　　2.4 ELISA检测化疗药物多西他赛处理或对照组细胞系A549对其分泌CCL20能力的影响;
　　2.5 统计分析非小细胞癌组织中CCL20表达水平与临床分期及生存期的影响。
　　结果:
　　3.1 RT-PCR和免疫组化结果均显示，趋化因子CCL20在非小细胞肺癌组织中表达水平高于相对应的癌旁组织;
　　3.2 非小细胞肺癌组织中，趋化因子CCL20与Treg细胞标志物CD4和Foxp3表达水平均呈正相关，且与炎性因子IL-10表达正相关;
　　3.3 流式细胞术结果显示，非小细胞肺癌组织部位TIL中Treg亚群比例远高于外周血PBMC，且CCR6+Treg细胞比例在TIL中比例高于PBMC;
　　3.4 趋化因子CCL20在临床终末期（Ⅲ-Ⅳ期）非小细胞肺癌患者中表达水平高于早期患者(Ⅰ-Ⅱ期);
　　3.5 化疗药物多西他赛处理非小细胞肺癌细胞系降低了细胞系表达CCL20的水平。
　　结论:
　　趋化因子CCL20及其受体CCR6在非小细胞肺癌中可以增强Treg细胞向癌组织迁移运动的能力，化疗药物多西他赛可以降低CCL20的表达水平，可能具有降低Treg向癌组织迁移运动的能力。
　　第二部分 细胞因子IL-32在食管癌中的表达特征及其免疫学功能
　　目的:
　　研究IL-32在食管鳞癌组织招募Tregs细胞的相关机制，以期对该类疾病的治疗提供新的方法与思路。
　　方法:
　　2.1 采用RT-PCR方法检测IL-32、Foxp3、CXCL8等基因标记分子在食管癌组织、癌旁组织或细胞系中的表达;
　　2.2 采用免疫组化法检测IL-32蛋白在食管癌组织中的表达水平;
　　2.3 采用siRNA技术敲除IL-32在食管癌细胞系TE1表达水平，并进一步检测其对CXCL8表达水平及Treg细胞迁移的影响;
　　2.4 流式细胞术检测Treg细胞在食管癌组织(TIL)和外周血中(PBMC)的分布情况。
　　2.5 采用SPSS17.0分析IL-32表达水平与食管癌患者临床数据及术后生存期间的相关性;
　　结果:
　　3.1 RT-PCR结果显示，IL-32在食管癌组织中的表达高于癌旁组织;细胞系分析结果显示，IL-32在食管正常细胞(Het-1α)中表达水平较低，在食管癌细胞系中表达水平存在较大差异，在TE1中表达最高，而KYSE450和KYSE70中几乎无表达;
　　3.2 RT-PCR结果显示，IL-32表达水平与趋化因子CXCL8表达呈正相关，而IL-32表达水平与浸润的Treg细胞呈正相关;
　　3.3 流式细胞术结果显示，食管癌肿瘤组织中Treg细胞比例远高于外周血中比例;且TIL中CXCR2+Treg细胞所占比例高于PBMC。
　　3.4 siRNA敲除细胞系TE1中IL-32基因，CXCL8在基因水平和蛋白水平表达水平均降低，Treg细胞的迁移能力明显降低;
　　3.5 临床分析结果显示，IL-32表达水平与食管癌患者临床分期、分化水平均呈负相关，且发生淋巴结转移的患者表达IL-32的比例比未发生淋巴结转移的患者比例高;IL-32表达水平与食管癌患者术后生存期呈负相关。
　　结论：
　　细胞因子IL-32参与食管癌局部微环境的形成，通过促进趋化因子CXCL8的表达水平上调Treg细胞向肿瘤部位的迁移能力和比例。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

第一部分 趋化因子CCL20在非小细胞肺癌组织部位对Treg细胞迁移运动能力影响的研究

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 总结

参考文献

第二部分 细胞因子IL-32在食管癌中的表达特征及其免疫学功能

1 前言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

综述 肿瘤免疫抑制微环境对肿瘤免疫的影响

个人简历及在读博士期间发表的论文