丹参酮ⅡA磺酸钠对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌纤维化的影响

摘要

背景与目的:
　　心肌纤维化（ cardiac fibrosis, CF）指在致病因素作用下，细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过量沉积，最终导致心脏收缩舒张功能受损的病理性改变。其中活性氧（reactive oxygen species，ROS）与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是导致心肌纤维化的重要因素。ROS能够通过直接作用或者间接通过多种信号途径引起心肌纤维化。血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）是重要的致纤维化因子，它能够激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶，诱导 ROS的大量生成。ROS的大量生成和抗氧化反应的失衡造成机体发生氧化损伤，引起ECM表达和代谢发生改变，造成胶原纤维的大量沉积，导致心肌纤维化。
　　转录因子NF-E2相关因子2（nuclear factor-erythroid related factor-2，Nrf2）是细胞内重要的抗氧化因子。在正常生理情况下， Nrf2和它的胞质接头蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein1，Keap1）偶联，被泛素化后降解，保持Nrf2在细胞内的低浓度、低活性状态。当氧化应激发生时，Keap1与Nrf2解偶联，Nrf2转移入核。进入细胞核内的Nrf2与肌腱膜纤维肉瘤蛋白（musculoaponeurotic fibrosarcoma protein, Maf）等小分子蛋白形成异二聚体，与抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）结合，启动下游受Nrf2所调控的抗氧化酶和II相解毒酶的表达，增强细胞的抗氧化应激能力。
　　丹参酮IIA（tanshinone IIA，Tan IIA）是我国传统中药丹参的重要活性成分。丹参酮IIA磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulfonate, STS）是丹参酮IIA经磺化而得到的水溶性药物，具有更高的生物利用度。因 STS具有抗氧化应激、抗纤维化、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集、保护心肌等作用而被广泛用于心血管疾病的治疗。但是其具体的抗纤维化、抗氧化机制尚未完全阐述清楚。
　　本实验通过皮下植入微量渗透泵缓释Ang II构建大鼠心肌纤维化模型，给予不同剂量STS干预，观察STS对Ang II诱导的心肌纤维化的影响，以及STS抗纤维化的机制是否依赖于Keap1-Nrf2信号通路。
　　方法:
　　40只SD大鼠随机分为5组，分别为对照组，模型组，低、中、高剂量STS组。采用皮下植入微量渗透泵缓释Ang II建立大鼠心肌纤维化模型，各STS组给予不同剂量STS干预。3周后，采用苏木精伊红和马松染色法观察心肌纤维化程度；采用RT-qPCR和Western blot检测心肌组织中I型胶原（Collagen I）、III型胶原（Collagen III），Nrf2和它的胞质接头蛋白Keap1,以及Nrf2所调控的抗氧化酶和II相解毒酶mRNA水平及其蛋白水平；采用比色法检测心肌组织中丙二醛、谷胱甘肽水平及超氧化物歧化酶活性。
　　结果:
　　对照组大鼠心肌组织未见明显炎性细胞浸润、心肌细胞坏死，心肌纤维排列均匀致密；模型组大鼠心肌组织可见明显灶状坏死、心肌纤维断裂、大量炎性细胞浸润；各STS组心肌损伤程度随着STS剂量的增加逐渐减轻，于高剂量STS组改善更为明显。
　　对照组大鼠未见明显蓝色胶原纤维沉积，红色的细胞质、心肌纤维排列正常；模型组可见明显密集、融合的蓝色胶原纤维纤维，CVF值显著升高，表明Ang II能够诱导胶原纤维的异常增生、沉积，导致心肌纤维化的发生；各 STS组蓝色胶原纤维分布稀疏，融合程度随STS剂量增加逐渐减低，CVF值逐渐减少。模型组心肌组织中Collagen I与Collagen III的mRNA含量显著增加。中、高剂量STS组Collagen I和Collagen III的mRNA表达水平下调。与模型组、低剂量STS组相比，高剂量STS可以显著降低Collagen I和Collagen III的蛋白表达水平（分别为P<0.001，P<0.001和P<0.05，P<0.05）。
　　模型组Keap1与Nrf2 mRNA水平均轻度增加。随着STS剂量的增加，各组Keap1 mRNA表达水平逐渐减低，Nrf2 mRNA表达水平逐渐增加。模型组Keap1、细胞核 Nrf2蛋白水平与对照组相比轻度增加（P<0.01，P<0.05），细胞质 Nrf2蛋白表达水平没有明显改变（P>0.05）。与模型组相比，中剂量STS组Keap1和细胞质Nrf2蛋白含量轻度减低（P<0.01，P<0.05），细胞核Nrf2蛋白含量轻度增加（P<0.01）。高剂量STS组与模型组、低剂量STS组相比，Keap1和细胞质Nrf2蛋白含量显著减低（P<0.001，P<0.01和P<0.01，P<0.01），细胞核Nrf2蛋白含量显著增加（P<0.001，P<0.05）。与对照组相比，模型组HO-1 mRNA含量轻度增加（P<0.05），NQO1和GCLC mRNA含量没有显著变化。与模型组、低剂量STS组相比，高剂量STS组HO-1、NQO1、GCLC mRNA含量均显著增加。
　　与对照组相比，模型组MDA含量显著增加，SOD活性显著降低（P<0.01， P<0.01）。各STS组MDA含量随STS剂量的增加而逐渐减低，SOD活性逐渐增加。与模型组相比，中、高剂量STS组GSH含量明显增加（P<0.05，P<0.01）。
　　结论:
　　1. STS能够减轻Ang II诱导的大鼠心肌纤维化；
　　2. STS能够呈剂量依赖性的促进Nrf2核聚集；
　　3. STS能够减轻Ang II诱导的大鼠心肌组织氧化应激水平，增加大鼠心肌细胞抗氧化能力。

目录

声明

中英文缩略词对照表

前言

材料与方法

1 实验材料和实验仪器

2 实验方法

结果

1 STS减轻Ang II引起的大鼠心肌病理形态学改变

2 STS减轻Ang II诱导的大鼠心肌纤维化

3 STS促进Nrf2核聚集

4 STS上调大鼠心肌组织中抗氧化酶及II相解毒酶的表达

5 STS减轻大鼠心肌组织脂质过氧化水平、增强大鼠心肌组织抗氧化应激的能力

讨论

结论

参考文献

综述:心肌纤维化疾病相关分子和信号通路研究进展

个人简历、硕士期间发表的论文

致谢