长链非编码RNA AURKAPS1在肝细胞癌中的功能及分子机制研究

摘要

肝癌是严重威胁我国人民生命健康的重大疾病，其发病率和死亡率长期以来分别高居我国恶性肿瘤的第四和第二位。原发性肝癌主要分为三种亚型：肝细胞肝癌,是最主要的一种亚型，约占原发性肝癌的85％；胆管细胞型肝癌，作为第二大类型，其发病率也不断增加；以及混合型肝癌，包含肝细胞癌与胆管细胞癌两种成分。尽管随着医学技术的不断发展进步，肝癌的综合治疗已经取得很大的成就，但肝癌的复发、转移导致治疗效果仍不容乐观，因此明确肝癌侵袭转移的机制对于提高肝癌的治疗效果更是具有重要意义。
　　长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200bp的非编码RNA。LncRNA有多种来源，其中主要为：长的基因间 RNAs(LincRNAs)、长的内含子非编码RNA、基因的反义链、启动子相关长非编码 RNA、增强子 RNAs、假基因、3’端非编码区以及长的应激诱导的非编码转录本等。同蛋白编码基因类似，长非编码RNA主要由Ⅱ型RNA聚合酶（RNA polⅡ）转录而来，并且具有独立的启动子、转录因子结合区、表观遗传学修饰、外显子及内含子。一些研究发现lncRNAs可以通过与多梳抑制复合物（polycomb repressive complex, PRC）结合，调节染色体重塑和基因的表达。此外 LncRNA还可以通过与某些转录因子结合改变其转录活性或稳定性间接调节下游基因的表达；也可作为竞争性 RNA(ceRNA)通过与一些miRNAs结合抑制其功能进而促进miRNA下游靶基因的表达。
　　近年来一些研究发现，超过4%的LncRNA在病毒性肝炎中的表达发生改变。其中hDERH(human ortholog RNA of Rreh)的低表达与病毒性肝炎引起的肝癌的预后密切相关。HOTAIR（HOX antisense intergenic RNA）作为目前研究最为广泛的LncRNA，其表达在肝癌组织中显著升高，并且较高水平的HOTAR与肝癌的复发、淋巴结转移相关。这些发现提示了 LncRNA可成为肿瘤风险评估指标、诊断标志物以及新的肿瘤治疗靶点。
　　极光激酶A（Aurora kinase A，AURKA）是一种重要的丝苏氨酸蛋白激酶，在细胞有丝分裂、减数分裂过程中发挥着关键的调节作用。AURKA通过磷酸化微管相关蛋白、马达蛋白等促进微管的聚合，参与纺锤体形成，促进姐妹染色单体的分离。在肿瘤细胞中AURKA参与P53和BRCA1等介导的DNA损伤过程.过表达AURKA能够增强了肿瘤对化疗药物的耐受性。一些研究表明AURKA的高表达可以调节上皮-间质细胞转化（ EMT）促进肿瘤的复发和转移。AURKAPS1作为AURKA的假基因，位于1号染色体RAB3GAP2（RAB3 GTPase activating non-catalytic protein subunit2）内含子区，是一种LncRNA,而对于其在肿瘤中的表达和功能尚未见报道。本研究拟通过 Real-time PCR技术检测AURKAPS1在肝癌组织中的表达，然后通过构建过表达细胞系研究其在肝癌中的功能，同时初步探讨AURKAPS1发挥细胞生物学功能的分子机制。
　　本研究课题以 lncRNA AURKAPS1作为重点，通过以下三个部分对AURKAPS1在肝癌中的表达、功能和分子机制进行研究。
　　第一部分：lncRNA AURKAPS1在肝细胞癌组织中的表达以及与临床病理学特征的相关性分析
　　研究方法：
　　1.利用UCSC基因组数据库分析AURKAPS1基因基因组定位与同源性分析。
　　2.采用Blast软件对AURKA基因与AURKAPS1基因进行序列分析。
　　3.采用Real-Time qPCR检测lncRNA AURKAPS1在124对肝细胞肝癌及其配对癌旁组织中的表达。
　　4.所有数据均采用 SPSS17.0进行统计分析。采用单个样本 t检验分析AURKAPS1表达差异，单因素方差分析评估AURKAPS1的表达量与临床病理特征间的关系。
　　结果：
　　1. AURKAPS1位于1号染色体上RAB3GAP2基因的第一个内含子内，脊椎动物中不具有保守性。
　　2. AURKAPS1基因与AURKA基因序列相比缺少AURKA编码区359-560的序列，3’段约有25bp差异序列，同时具有部分序列的缺失和突变。
　　3. AURKAPS1 mRNA在肝癌肿瘤组织中的表达显著升高（ p<0.05），且AURKAPS1的表达与肿瘤大小和TNM分期密切相关（p<0.05），而与性别、年龄、肝炎病史、淋巴结转移等无关(p>0.05)。
　　第二部分： lncRNA AURKAPS1对肝癌细胞增殖、侵袭转移功能的影响
　　研究方法：
　　1.利用慢病毒包被的 AURKAPS1质粒感染肝癌细胞构建 AURKAPS1过表达细胞系。
　　2.利用 CCK-8细胞增殖实验、克隆形成和流式细胞分选方法体外检测过表达AURKAPS1对肝癌细胞增殖能力的影响。
　　3.采用皮下注射裸鼠荷瘤实验体内检测过表达AURKAPS1对肝癌细胞增殖能力的影响。
　　4.利用划痕实验和Transwell方法体外检测过表达AURKAPS1对肝癌细胞运动、迁移、侵袭的影响。
　　5.采用尾静脉注射裸鼠荷瘤实验体内检测过表达AURKAPS1对肝癌细胞侵袭转移的影响。
　　结果：
　　1.过表达AURKAPS1促进肝癌细胞的从G1期向G2/S转变，促进细胞体外增殖。
　　2.分别接种 AURKAPS1过表达组和对照组裸鼠两侧皮下，4周后处死小鼠，剥离肿瘤组织块，称量组织重量，结果显示过表达AURKAPS1促进肝癌细胞体内增殖。
　　3.划痕实验与Transwell实验结果显示AURKAPS1增强肝癌细胞运动、迁移和侵袭能力。
　　4.裸鼠尾静脉注射显示过表达AURKAPS1促进肿瘤细胞肝转移。
　　第三部分： lncRNA AURKAPS1调控肝癌细胞侵袭转移的分子机制研究
　　研究方法：
　　1.通过DIANA TOOLS软件分析可结合AURKAPS1序列的潜在miRNAs。
　　2.通过 STARBASE软件对高评分结合 miRNA进行功能预测，寻找筛选miRNAs的调控基因。
　　3. Western Blot实验检测过表达AURKAPS1后潜在下游基因RAC1与 ERK1/2蛋白表达的改变。
　　4.构建 RAC13’UTR报告基因质粒，荧光素酶实验筛选可调控 RAC1的miRNAs。
　　5.构建 AURKAPS1报告基因质粒，荧光素酶实验验证可结合 AURKAPS1的潜在miRNAs。
　　6. Western Blot验证AURKAPS1对miRNAs调控RAC1的影响。
　　7.免疫荧光检测过表达AURKAPS1后对细胞膜皱褶形成的影响。
　　8.免疫组织化学检测下游靶基因RAC1在100例肝癌组织总的表达。
　　结果：
　　1.生物信息学分析显示miR-218、miR-134、miR-636、miR-192、miR-182等多个miRNAs可能与AURKAPS1结合。
　　2.基因功能分析显示AURKAPS1可能调控RAC1、MAPK1等多个基因的表达。
　　3. Western Blot显示AURKAPS1能够上调RAC1的蛋白表达。
　　4.报告基因显示miR-142、miR-155和miR-182能够同时调节AURKAPS1和RAC1。
　　5. AURKAPS1能够促进肝癌细胞膜褶皱的形成。
　　6. RAC1在肝癌组织中的表达显著升高。
　　全文结论：
　　1. AURKAPS1在肝癌中表达显著升高，较高水平的AURKAPS1与肿瘤大小及TNM分期相关。
　　2. AURKAPS1促进肝癌细胞在体内与体外的生长增殖。
　　3. AURKAPS1促进肝癌细胞运动、迁移、侵袭与转移。
　　4. miR-142、miR-155、miR-182、miR-194、miR-218能够调节肝癌细胞内RAC1的表达。
　　5. RAC1在肝癌组织中的表达显著高于癌旁组织。AURKAPS1可通过结合miR-182、miR-155和miR-142促进肝癌细胞内RAC1蛋白的表达，活化ERK通路，促进细胞膜褶皱的形成。

目录

声明

英文缩略语

引言

第一部分：lncRNA AURKAPS1在肝癌组织中的表达以及与临床病理学特征的相关性分析

前言

1．材料设备与方法

2.实验结果

3. 讨论

4. 小结

参考文献

第二部分：lncRNA AURKAPS1对肝癌细胞增殖、侵袭转移功能的影响

前言

1．材料设备与方法

2.实验结果

3. 讨论

4. 小结

参考文献

第三部分：LncRNA AURKAPS1调控肝癌细胞侵袭转移的分子机制的研究

前言

1．材料设备与方法

2.实验结果

3.讨论

4．小结

参考文献

全文结论

综述:长链非编码RNA与肝癌发生发展的研究进展

1. LncRNA在肿瘤中的研究概况

2. 肝癌相关的LncRNA

3. LncRNA在肝癌中的调控作用

4. LncRNA与肝癌的诊断治疗

5. 展望

参考文献

个人简历

攻读博士学位期间发表文章

致谢