LncRNA5322在毛囊干细胞增殖、分化及皮肤损伤修复中的作用及其机制

摘要

皮肤作为人体表面积最大的组织器官，与外界接触最为广泛，是机体对外来多种侵袭进行有效抵抗和防御的首要屏障，保护体内组织和器官免受各种外界刺激。由于人体皮肤长时间暴露于人体最外层，常与外来多种致病因素广泛接触，所以各种原因直接或间接诱导的皮肤损伤在临床上极为常见，特别以烫伤、烧伤为代表的急性皮肤损伤最为多见，而诸如体表慢性溃疡等慢性皮肤损伤也是我国农村地区常见病，理论上皮肤大面积缺损发生后，需要及时对皮肤创面进行有效覆盖;如果皮肤缺损面积过大，超过了机体的修复能力而无法自愈，则需要进行皮肤移植，目前临床上皮肤移植最大的限制性因素为皮肤附属器官的缺乏。毛囊作为人体皮肤附属器官，虽然在形态结构上极其微小，但其功能上却非常强大，毛囊干细胞(Hair follicle stem cells，HFSCs)作为毛囊结构中广泛分布的一种独特干细胞，表现出多向分化能力，能阶段性分化形成毛囊、皮脂腺、表皮，在毛发的再生以及毛色的表型中具有非常重要的作用，可以作为种子细胞成为组织工程学皮肤构建的研究热点。
　　长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，被定义为在干细胞的增殖和分化中起重要作用的非蛋白质编码转录物。研究发现，LncRNA在表达或功能方面的异常化，可能会一定程度上诱导人类疾病的发生和进展，这不局限于癌症等重大恶性病，也在诸如退行性神经疾病等慢性病中有所体现。LncRNA的异常化具体表现在LncRNA在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等。研究表明LncRNA AK015322主要富集在睾丸组织中，能够通过诱捕microRNA-19b-3P促进精原干细胞(C18-4)的增殖。miRNA(microRNA)为动植物中大量存在的一类内源性非编码单链小分子RNA，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，具有多种生物学功能，可靶向作用于相应mRNA，从而抑制其翻译过程，进而调控该区域基因。miR-21是研究最早也是较特殊的miRNA之一，其在几乎所有的实体肿瘤中均呈现高表达。miR-21通过作用于靶基因调控胰腺癌发生发展，在胰腺癌干细胞增殖、分化、迁移、侵袭以及肿瘤耐药性等起发面关键作用。PI3K/AKT是人体内较为常见的信号通路，在人类肿瘤、代谢紊乱、肾脏疾病以及精神障碍等疾病中发挥着重要的作用，对细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等有不同程度影响。
　　因此探究长链非编码RNA对于毛囊干细胞增殖分化及其在皮肤损伤修复中的作用具有十分重要的研究意义。
　　第一部分 LncRNA5322促进毛囊千细胞的增殖和分化
　　目的：
　　构建LncRNA5322的过表达载体，探索LncRNA5322对于毛囊干细胞的增殖和分化的影响。
　　方法：
　　利用质粒pcDNA3.1构建LncRNA AK015322过表达载体，构建成功后转染到毛囊干细胞中，为LncRNAAK015322过表达组。另外对照组转染空载体pcDNA3.1。利用油红O染色法以及CCK-8试剂盒检测两者细胞系的增殖与分化情况，利用酶标仪检测OD值，根据OD值探索LncRNA5322对于毛囊干细胞增殖与分化的影响。
　　结果：
　　1.将构建好的质粒转染到培养的毛囊干细胞中，利用实时定量PCR检测转染效果。结果发现LncRNA5322的转染确实增加HFSCs中的LncRNA5322表达。
　　2.与对照组比较，LncRNA5322转染刺激HFSCs的增殖（P＜0.05）。
　　3.与对照组比较，LncRNA5322转染促进HFSCs的增殖分化(P＜0.05)。
　　结论：
　　Lnc RNA5322促进毛囊干细胞的增殖和分化。
　　第二部分 LncRNA5322通过PI3K/AKT信号途径调节毛囊干细胞增殖和分化
　　目的：
　　研究LncRNA5322是通过哪些信号途径调节毛囊干细胞增殖和分化。
　　方法：
　　第二部分利用上一部分构建的AK015322过表达载体，首先通过生物信息学分析预测AK015322与miR-21之间的相互联系，而后利用实时定量PCR检测过表达与对照组细胞系中miR-21的表达水平，利用流式细胞仪探究两组毛囊干细胞的细胞周期情况，再次通过实时定量PCR与蛋白印迹的方法验证细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1、CDK2)mRNA和蛋白质表达，同时利用Western blot检测pAKT/AKT相关通路的表达情况;相反的利用miR-21激动剂（agomir-21），再次利用Western blot从反方向验证了pAKT/AKT相关通路的表达情况。
　　结果：
　　1.通过在线microRNA-target程序预测了miRNA的靶定位点，找出了常见的5322相关结合位点的miRNAs，即miR-21和miR-19b-3p。其中miR-19b-3p已有报道与促进精原干细胞C18-4的增殖相关。LncRNA5322可以上调miR-21(P＜0.05)。
　　2.同时LncRNA5322转染促进HFSCs中的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1、CDK2)mRNA和蛋白质表达。
　　3.LncRNA5322上调毛囊干细胞中PI3K和AKT的表达和磷酸化水平(P＜0.05)。
　　4.miR-21激动剂（agomir-21）消除了LncRNA5322在HFSCs中增加的PI3K和AKT的表达和磷酸化水平（P＜0.05）。
　　结论：
　　LncRNA5322通过PI3K/AKT信号途径调节毛囊干细胞增殖和分化。
　　第三部分 LncRNA5322在皮肤损伤修复中的作用
　　目的：
　　构建裸鼠皮肤伤口模型，探索LncRNA5322在皮肤损伤修复中的作用。
　　方法：
　　应用裸鼠，建立皮肤损伤动物模型，随机分为Sham组（10只），创伤模型组、(10只）以及LncRNA5322处理的创伤模型组（10只）。伤口形成后不进行包扎以及用药的处理，放置于无菌的实验室内单独饲养，每天进行消毒工作;另外LncRNA5322处理的创伤模型组利用Antagonist LncRNA5322接种手术刀片割伤后的伤口创面。在损伤形成后的第1天、第3天以及第6天对伤口拍照，利用免疫组化以及白细胞计数等方法观察LncRNA5322对于皮肤创伤愈合能力的影响。
　　结果：
　　1.在创伤形成后的第1，3，6天，接种转染过表达LncRNA5322质粒的毛囊干细胞处理的伤口面积缩小至原损伤的87.6％，70％，50.6％。在创伤形成后的第1，3，6天，接种常规毛囊干细胞的伤口面积缩小至原损伤的90.9％，79.1％，61.5％。未经任何处理的对照组伤口面积缩小至原伤口面积的95％，90.5％，85％。光镜下发现嗜中性粒细胞减少，大量单核细胞由多到少，成纤维细胞也明显增加。
　　2.LncRNA5322促进表皮及附属器官再生:在创伤形成后的第14天，接种转染过表达LncRNA5322质粒的毛囊干细胞处理的伤口的表皮基本愈合并开始生长体毛，接种常规毛囊干细胞的伤口表皮并未完全愈合，未经任何处理的对照组伤口面积缩小至原伤口面积的78.5％。在创伤形成后的第20天，接种转染过表达LncRNA5322质粒的毛囊干细胞处理的伤口的表皮完全愈合且生长的体毛已经达到2mm，接种常规毛囊干细胞的伤口表皮基本愈合并开始生长体毛，未经任何处理的对照组伤口面积缩小至原伤口面积的51.2％。
　　结论：
　　转染LncRNA5322过表达质粒的毛囊干细胞可以促进伤口收缩并且促进表皮以及附属物生长(P＜0.05)。

目录

声明

摘要

主要英文缩略词索引

引言

第一部分 Lnc RNA5322促进毛囊千细胞的增殖和分化

1 材料与方法

1．1 主要试验仪器

1．2 主要实验试剂

1．3 细胞来源

2 方法

2．1 构建载体

2．2 转染LncRNA5322测定

2．4 细胞增殖和分化

2．5 统计分析

3 结果

3．1 LncRNA 5322在HFSCs中的表达检测

3．2 LncRNA5322对毛囊干细胞增殖的影响

3．3 LncRNA5322对毛囊千细胞分化的影响

3．4 LncRNA5322对CDK1和CDK2的表达影响

4 讨论

5 结论

第二部分 Lnc RNA5322通过PI3K／AKT信号通路调节毛囊干细胞增殖和分化

1 材料

1．1 主要实验设备

1．2 主要实验试剂

1．3 细胞来源

2 方法

2．1 转染LncRNA5322或miR-21测定

2．2 构建载体

2．3 实时定量PCR(RT-PCR)

2．4 Western blotting

2．5 荧光素酶报告分析

2．6 细胞增殖和分化

2．7 统计学分析

3 结果

3．1 生物信息学分析

3．2 LncRNA5322对miR-21的表达影响

3．3 miR-21表达检测结果

3．4 miR-21转染对HFSCs增殖和分化的影响

3．6 miR-21激动剂转染对LncRNA5322介导的HFSCs增殖分化的影响

3．7 LncRNA5322上调毛囊干细胞中PDK和AKT的表达量

3．8 LnclRNA5322上调毛囊干细胞中PI3K和AKT的磷酸化水平

3．9 PI3K／AKT抑制剂对LncRNA5322介导的HFSCs增殖分化的影响

3．10 PI3K和AKT的荧光素酶表达检测

3．12 Agomir-21对HFSCs中pPI3K／pAKT磷酸化的影响

3．13 Agomir-21对LncRNA5322介导的HFSCs中PI3K／AKT表达的影响

3．14 Agomir-21对LncRNA5322介导的HFSCs中pPI3K／pAKT磷酸化的影响

4 讨论

5 结论

第三部分 长链非编码RNA 5322在皮肤损伤修复中的作用

1 材料与方法

1．1 主要实验设备

1．2 主要实验试剂

1．3 实验动物以及分组

1．4 构建载体

1．5 琼脂糖凝胶电泳

1．6 基因过表达载体的细胞转染

1．7 免疫组织化学染色

1．8 白细胞计数

1．9 统计学分析

2 结果

2．1 LncRNA5322促进伤口收缩

2．2 Lnc RNA5322促进表皮及附属器官再生

3 讨论

4 结论

全文结论

参考文献

综述 毛囊干细胞研究进展

个人简历及博士期间发表文章

致谢