缺血再灌注对人肝内胆管上皮细胞上皮间质转变的影响及其机制

摘要

目的 1. 研究缺血再灌注对人肝内胆管上皮细胞上皮间质转变（epithelial mesenchymal transitions，EMT）的影响。 2. 初步探讨缺血再灌注促进人肝内胆管上皮细胞发生EMT的机制。 方法 1. 人肝内胆管上皮细胞（Human Introhepatic Biliary epithelial Cell，HIBEC）分为正常组和缺血再灌注组，分别在相应条件下培养和处理后收取蛋白。二喹啉甲酸（BCA）进行蛋白定量后，Western blot检测两组细胞中EMT相关蛋白(E-cadherin,Vimentin,FSP-1)的表达情况。 2. 浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L的Hedgehog抑制剂环巴胺（cyclopamine）预处理人肝内胆管上皮细胞12h后，采用CCK-8检测其对细胞活性的影响,并绘制IC50曲线?CCK-8研究正常培养和缺血再灌注条件下加入Hh抑制剂与否及不同缺血再灌注时间对人肝内胆管上皮细胞生长的影响,并绘制生长曲线?Western blot检测正常培养和缺血再灌注培养条件下加入Hh抑制剂与否对人肝内胆管上皮细胞中 SHH,SMO,Gli 及 EMT 相关蛋白(E-cadherin,Vimentin)的表达情况? 结果 1. Western blot结果显示缺血再灌注培养组人肝内胆管上皮细胞E-cadherin表达量低于正常培养组；而FSP-1和Vimentin蛋白表达量则高于正常培养组，并且这一现象在再灌注6h时最为明显。 2. 根据CCK-8测定Hedgehog抑制剂环巴胺对人肝内胆管上皮细胞活性的影响绘制IC50曲线，确定18.68μmol/L为环巴胺预处理细胞的最适宜药物浓度；为方便操作，在实验过程中，我们选取20μmol/L为预处理细胞的药物浓度。在CCK-8 测定不同处理组人肝内胆管上皮细胞的生长曲线中，缺血再灌注组生长速率均低于正常培养组，并且在加药后 1h、6h 和 12h时均有统计学意义（P＜0.05）；其中加药组又分别低于不加药组，并且这一现象在缺血再灌注处理组尤为明显（P＜0.001）。Western blot检测发现相比于正常培养组，缺血再灌注组细胞SHH、SMO、Gli表达量均有上调，表明缺血再灌注处理后人肝内胆管上皮细胞中Hh信号通路被活化。采用环巴胺干预的方法对人肝内胆管上皮细胞进行预处理后，Gli的表达量明显减少，表明Hedgehog信号通路的活化作用被抑制；同时相比于单纯缺血再灌注组，药物预处理组细胞 Vimentin的表达降低，而E-cadherin的表达量则增高，表明细胞上皮间质转变被抑制。 结论 1. 缺血再灌注可以引起人肝内胆管上皮细胞发生上皮间质转变。 2. 缺血再灌注可能通过激活 Hedgehog 信号通路促进人肝内胆管上皮细胞发生上皮间质转变，阻断该信号通路可显著减轻这一过程的发生。

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