EphA2在地塞米松作用的人晶状体上皮细胞中的表达变化及其意义

摘要

本研究共分为三部分论述:
　　第一部分 不同浓度地塞米松对人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响和EphA2的表达变化
　　目的:
　　观察不同浓度地塞米松作用后，人晶状体上皮细胞(HLE-B3)增殖和凋亡的变化及细胞中EphA2的表达变化。
　　方法:
　　根据地塞米松浓度的不同，分为以下5组:0mol/L组（空白对照组）、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组和10-4mol/L组。地塞米松作用人晶状体上皮细胞(HLE-B3)48h后，CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率;Tunel检测凋亡指数，流式细胞仪检测凋亡率;Western blot检测EphA2蛋白的表达水平。
　　结果:
　　1.CCK-8结果显示:0mol/L组（空白对照组）、10-7mol/L组、10-6mol/L、10-5mol/L组和10-4mol/L组细胞存活率分别为(98.24±1.74)％、(108.62±1.32)％、(73.13±3.41)％、(53.36±3.75)％和（44.85±3.18）％。5组的总体比较差异有统计学意义(F=1497.598，P=0.001);5组中任意两组比较，差异亦有统计学意义(P值均为0.001)。与对照组比较，10-7mol/L组细胞存活率明显升高;10-6mol/L组、10-5mol/L组及10-4mol/L组HLE-B3存活率逐渐下降。10-5mol/L组HLE-B3的存活率为（53.36±3.75）％,接近半数致死剂量。
　　2.Tunel检测结果:0mol/L组（对照组）、10-7mol/L组、10-6mol/L组、10-5mol/L组和10-4mol/L组HLE-B3凋亡指数分别为(4.9±1.2)％、（4.8±0.8）％、(17.1±3.0)％、（25.3±3.6）％和(28.4±4.1)％。5组的总体比较差异有统计学意义(F=1972.95，P=0.001)。10-7mol/L组的凋亡指数略低于0mol/L组（对照组），但差异无统计学意义(P=0.756);余任意两组比较，差异均有统计学意义(P值均=0.001)。
　　3.流式细胞术检测结果:0mol/L组（空白对照组）、10-7mol/L组、10-6mol/L、10-5mol/L组和10-4mol/L组HLE-B3凋亡率分别为(5.9±1.0)％、(5.7±1.5)％、(25.4±4.3)％、(30.8±5.5)％和（33.7±4.7）％。5组的总体比较差异有统计学意义(F=438.99，P=0.001)。10-7mol/L组的凋亡率略低于0mol/L组（对照组），但差异无统计学意义(P=0.916)，余任意两组比较，差异均有统计学意义(P值均=0.001)。与Tunel检测结果检测结果一致。
　　结论:
　　1.地塞米松浓度为10-7mol/L时，可促进晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时，可抑制晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的增殖。
　　2.地塞米松浓度为10-7mol/L时，对晶状体上皮细胞HLE-B3细胞的凋亡无影响;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时，可促进晶状体上皮细胞HLE-B3的凋亡，且呈剂量依赖性。
　　3.地塞米松浓度为10-7mol/L时，晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达上调;地塞米松浓度为10-6mol/L至10-4mol/L时，晶状体上皮细胞HLE-B3中EphA2蛋白的表达下调。
　　第二部分 人EphA2基因慢病毒表达载体构建及体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的实验研究
　　目的:
　　构建人EphA2基因表达载体，包装慢病毒。探索人EphA2基因慢病毒表达载体体外转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值;CCK-8检测载体的细胞毒性;嘌呤霉素筛选转染阳性细胞;Western blot检测筛选细胞及筛选细胞传代后EphA2蛋白的表达水平。
　　方法:
　　1.慢病毒介导的人EphA2基因表达载体的构建以人cDNA-EphA2为模板，设计含NOTⅠ和XbaⅠ酶切位点的上下游引物，PCR扩增EphA2的CDS区。载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP双酶切后和扩增的目的基因EphA2以CE重组酶进行连接。转化感受态细菌后挑选正确的克隆行PCR、酶切及测序鉴定。应用Lipofectamine2000共同转染HEK293T/17细胞，包装慢病毒。72h后收获病毒原液，离心过滤，超速离心后将沉淀重悬得到病毒储存液，梯度法测定滴度。
　　2.分别以MOI值0、20、50、100、200转染人晶状体上皮细胞HLE-B3，转染72h后荧光显微镜下观察细胞形态，流式细胞术检测转染效率，探索最佳MOI值。
　　结果:
　　1.PCR、酶切和测序均证实EphA2慢病毒表达载体序列正确。HEK293T/17细胞包装后获得了病毒储存液，病毒的滴度为2.3×107TU/ml至2.7×107TU/ml。
　　2.MOI为0、20、50、100和200时，转染效率分别为0.0％、(38.6±3.9)％、(49.2±4.2)％、(79.5±5.5)％和(80.2±6.0)％，总体比较差异有统计学意义(F=2600.845，P=0.001);MOI=200与MOI=100比较，转染效率无明显提高(P=2.507)。MOI为0、20、50、100时，细胞形态无改变;MOI为200时，部分细胞形态不规则。
　　结论:
　　1.成功构建人EphA2慢病毒表达载体。
　　2.人EphA2慢病毒表达载体转染人晶状体上皮细胞HLE-B3的最佳MOI值为100，转染效率为(79.5±5.5)％。
　　3.外源性EphA2蛋白可在人晶状体上皮细胞HLE-B3中稳定高效表达。
　　4.EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞HLE-B3的增殖有促进作用。
　　第三部分 EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响
　　目的:
　　探讨EphA2基因过表达对正常人晶状体上皮细胞HLE-B3和地塞米松作用的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖和凋亡的影响及作用机制。
　　方法:
　　根据第一部分的实验结果，选择10-5mol/L地塞米松作为实验浓度。实验分为以下四组:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组。CCK-8检测各组细胞的存活率。Tunel检测凋亡指数，流式细胞术检测凋亡率，Western blot检测各组细胞BCL-2、Bax和Caspase-3的表达水平。
　　结果:
　　1.CCK-8结果显示:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组HLE-B3的存活率分别为(98.18±1.85)％、(122.01±3.89)％、(52.32±1.99)％、和(76.18±3.74)％。组间比较，差异有统计学意义(F=497.557，P=0.001);EphA2过表达细胞组存活率高于正常细胞组，差异有统计学意义(P=0.001);EphA2过表达细胞联合地塞米松组存活率高于正常细胞联合地塞米松组，差异有统计学意义(P=0.001）。
　　2.Tunel检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组的凋亡指数分别为(5.4±1.5)％、（5.0±1.3）％、（23.0±3.9）％、和（14.4±2.7）％。组间比较，差异有统计学意义(F=397.638，P=0.001);EphA2过表达细胞组凋亡指数略低于正常细胞组，但差异无统计学意义(P=0.415）;正常细胞联合地塞米松组凋亡指数较正常细胞组高，差异有统计学意义(P=0.026）;EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡指数低于正常细胞联合地塞米松组，差异有统计学意义(P=0.018)。
　　3.流式细胞术检测结果:正常细胞组、EphA2过表达细胞组、正常细胞联合地塞米松组、EphA2过表达细胞联合地塞米松组的凋亡率分别为（6.4±1.3）％、（6.1±1.5）％、（28.8±3.4）％和（18.5±2.0）％。4组总体比较，差异有统计学意义(F=2194.309，P=0.001);正常细胞组与EphA2过表达细胞组比较，差异无统计学意义(P=0.421);EphA2过表达细胞联合地塞米松组凋亡率高于EphA2过表达细胞组(P=0.001)，但低于正常细胞联合地塞米松组(P=0.015)。
　　结论:
　　1.EphA2基因过表达对正常状态下的人晶状体上皮细胞HLE-B3具有促增殖作用;对地塞米松导致的HLE-B3增殖抑制具有保护作用。
　　2.EphA2基因过表达对HLE-B3生理状态下的细胞凋亡无保护作用;对地塞米松导致的HLE-B3的凋亡具有保护作用。
　　3.EphA2通过上调BCL-2和阻止Bax和Caspase-3过表达发挥对地塞米松导致的HLE-B3凋亡的保护作用。

目录

声明

摘要

缩略语

前言

第一部分 地塞米松对人晶状体上皮细胞增殖、、凋亡和EphA2表达的影响

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2 结果

2．3 Tunel法检测HLE-B3凋亡

2．4 Annexin Ⅴ-APC／PI双染法检测细胞凋亡率

2．5 Western blot检测EphA2蛋白的表达

3 讨论

4 结论

参考文献

第二部分 人EphA2基因慢病毒表达载体构建及体外转染人晶状体上皮细胞的实验研究

1 材料与方法

2 结果

第二节 EphA2基因表达载体的慢病毒包装及滴度测定

1 材料与方法

2 结果

第三节 人EphA2基因慢病毒表达载体体外转染HLE-B3细胞及目的蛋白的表达

1 材料与方法

2 结果

讨论

结论

参考文献

第三部分 人EphA2基因过表达对HLE-B3和地塞米松作用的HLE-B3增殖及凋亡的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2 结果

2．1 CCK-8检测存活率

2．2 Tunel检测凋亡指数

2．3 Annexin Ⅴ-APC／PI双染法检测凋亡率

2．4 EphA2基因过表达对正常HLE-B3细胞和地塞米松作用的HLE-B3细胞中BCL-2／Bax和Caspase-3蛋白表达的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

全文结论

综述 糖皮质激素性白内障发病机制的研究进展

个人简历

致谢